重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶溫控型工程菌的構(gòu)建及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

凡 寧，張洪斌*，凌 凱，凌國慶，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶溫控型工程菌的構(gòu)建及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

凡 寧，張洪斌*，凌 凱，凌國慶，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法從蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）中擴(kuò)增了β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-cyclodextrin glucanotransferase，β-CGTase）基因，將該基因克隆到pBV220質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和酶切驗(yàn)證后，得到能表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌E.coli DH5α/pBVcgt。通過對(duì)工程菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，得到最佳產(chǎn)酶條件為：OD600nm值達(dá)到1.0、初始培養(yǎng)溫度30℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH8.0、溫度梯度誘導(dǎo)39℃培養(yǎng)0.5h，40℃培養(yǎng)0.5h，41℃培養(yǎng)1h，42℃培養(yǎng)2h。酶活力由優(yōu)化前的445U/mL提高到956U/mL，酶活力提高了1.15倍。溫度梯度誘導(dǎo)比直接誘導(dǎo)酶活力提高20%。該酶的克隆表達(dá)以及發(fā)酵條件的研究表明，該酶能在大腸桿菌原核表達(dá)體系中高效表達(dá)。

蠟狀芽孢桿菌；β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；工程菌；表達(dá)；培養(yǎng)條件

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glucanotransferase，CGTase，EC2.4.1.19）是一種重要的工業(yè)用酶，不僅能催化淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等α-1,4-葡萄糖聚合物合成環(huán)糊精（cyclodextrin，CD），也可用于一些糖類和配糖物的化學(xué)改性[1]。該酶屬于α-淀粉酶家族，是一種多功能型酶，除了具有環(huán)化作用，也具有耦合和歧化作用，同時(shí)還有弱的水解作用[2]。至今已從許多微生物中分離得到CGTase，如：Bacillus sp.[3]，Paenibacillus sp.[4]和Thermoanaerobacter sp.[5]，其中以Bacillus sp.為主。CD是由多個(gè)D-吡喃葡萄糖單元通過α-（1,4）糖苷鍵連接成的一類環(huán)狀低聚糖。目前常用的環(huán)糊精主要有3種，分別是由6、7、8個(gè)葡萄糖單元組成的α-、β-和γ-CD[6]。CDs是一種具有內(nèi)疏水外親水的筒形結(jié)構(gòu)，能與許多疏水客體化合物或功能基團(tuán)形成包含物，從而改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，這種特殊的性質(zhì)使環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7-11]。目前環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，但由于野生菌株的產(chǎn)酶能力普遍較低以及低的轉(zhuǎn)化率、加之生成的環(huán)糊精分離提純困難等原因，導(dǎo)致環(huán)糊精生產(chǎn)成本太高，限制了它們的擴(kuò)大生產(chǎn)和應(yīng)用。因此為了獲取適合工業(yè)化生產(chǎn)的CGTase產(chǎn)酶菌株，對(duì)CGTase進(jìn)行分子生物學(xué)研究，構(gòu)建工程菌株，獲得穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高、易于分離純化的重組CGTase越來越受到重視。Petrova[12]和Lee[13]等將CGTase基因克隆并轉(zhuǎn)入到E. coli體內(nèi)獲得了表達(dá)，Takano等[14]將β-CGTase基因克隆并整合到B.subtilis體內(nèi)，同樣獲得了表達(dá)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的重組CGTase工程菌均為異丙基硫代-β-D-半乳糖（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)型，IPTG價(jià)格昂貴且去除方法復(fù)雜，一些國家已經(jīng)明文規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白的發(fā)酵工藝中不能使用IPTG；本實(shí)驗(yàn)所使用的質(zhì)粒pBV220是溫控型的，操作簡單且成本低，所以倍受人們的青睞。

本實(shí)驗(yàn)室通過在篩選平板中加入酚酞的方法從土壤中分離出一株能產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-CGTase）的芽孢桿菌Bacillus cereus strain LGQ01，將其基因克隆到質(zhì)粒pBV220中，構(gòu)建了溫控型工程菌株E.coli DH5α/pBV220-CGTase（pBVcgt），并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究，這為今后環(huán)狀糊精的酶法制備及擴(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用打下了技術(shù)基礎(chǔ)，使該酶能更好的應(yīng)用在淀粉加工工業(yè)中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

Bacillus cereus strain LGQ01由本實(shí)驗(yàn)室篩選；菌株E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆質(zhì)粒PUC57和表達(dá)質(zhì)粒pBV220均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker、考馬斯亮藍(lán)R-250、氨芐青霉素（Amp）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、X-gal、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。普通LB培養(yǎng)基[15]，需要時(shí)加入終質(zhì)量濃度為100?g/mL的Amp。

1.2 方法

1.2.1 β-CGTase基因的克隆

基因克隆參考文獻(xiàn)[16]，以Bacillus cereus strain LGQ01的基因組DNA為模板，依據(jù)GenBank公布的Bacillus sp.菌株CGTase基因序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物為：上游引物：5’-CGCGGATCCATGATTCGCCA AGCTTTA-3’；下游引物：5’-AAAACTGCAGTTAC CAATTTGATATG-3’。上下游引物分別含有BamH I和Pst I限制性酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，1 min；72 ℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。將擴(kuò)增得到的β-CGTase基因與PUC57載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，采用藍(lán)白斑篩選后挑白色菌落在含有Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切電泳分析和序列鑒定。序列鑒定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的篩選

對(duì)測序鑒定后的質(zhì)粒PUC57-cgt和載體pBV220分別用BamH I和Pst I雙酶切，凝膠電泳回收后，T4 DNA連接酶16℃連接過夜。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化平板上經(jīng)Amp初步篩選，然后小量培養(yǎng)用酶切電泳分析方法篩選陽性克隆。

1.2.3 β-CGTase的表達(dá)和檢測

把含有重組質(zhì)粒的工程菌接種到含Amp的LB中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，然后按1%接種量轉(zhuǎn)接到含50 mL新鮮LB的三角瓶中，按上述培養(yǎng)條件至OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí)，42 ℃誘導(dǎo)6 h后，4 ℃、8 000×g離心20 min收集菌體進(jìn)行破碎，取上清檢測其活力，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳方法[17]分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4 酶水解活力的測定[18]

取10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 8.5）0.2 mL，再加入0.2 g/100 mL可溶性淀粉0.2 mL，振蕩，于40 ℃水浴10 min，立即加0.5 mol/L醋酸0.5 mL終止反應(yīng)，然后加入0.005%碘液顯色3 min，同時(shí)以蒸餾水為空白，不加酶液為對(duì)照，在700 nm波長處測定吸光度（A），一個(gè)酶活單位定義為使吸光度下降10%的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶工程菌的構(gòu)建及表達(dá)

將PCR產(chǎn)物與PUC57載體連接后，挑白色菌落小量培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒用BamH I和Pst I雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可在約2 100 bp處看到目的基因的條帶（圖1）。以測序確證的陽性克隆的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增β-CGTase基因，將經(jīng)BamH I和Pst I雙酶切后的目的基因與pBV220載體連接后，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pBVcgt（圖2）。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)中，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和雙酶切驗(yàn)證后，得到表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌。重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證如圖3所示。取上清測酶活，上清液中有明顯的酶活力，SDS-PAGE電泳圖如圖4所示。說明該酶在大腸桿菌中成功獲得表達(dá)。

圖1 重組克隆載體PUC57-ccggtt酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid PUC57-cgt by agarose gel electrophoresis

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220--cgtFig.2 Expression plasmid pBV220-cgt

圖3 重組表達(dá)載體pBV220-cgt酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid BV220-cgt by agarose gel electrophoresis

圖4 4 β-CGTase表達(dá)的SDS-PAGE分析AGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant β-CGTase from E. coli DH5α (pBVcgt)

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)開始時(shí)菌濃（OD600nm）對(duì)β-CGTase酶活力的影響

在50mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH7.0）中按1%接種量接入種子液后，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)到菌濃OD600nm值達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6時(shí)，42 ℃誘導(dǎo)6 h后取出培養(yǎng)液處理后測酶活，所得的工程菌菌濃與酶活力的關(guān)系如圖5所示。菌濃較低時(shí)，酶活力隨菌濃增加而增大，達(dá)到1.0時(shí)酶活力最高，之后酶活力降低。菌濃在1.0時(shí)，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長期，易于誘導(dǎo)而合成外源蛋白，因此表現(xiàn)出較高的活力，之后隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體比生長速率下降，而導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降。

圖5 誘導(dǎo)開始時(shí)菌體濃度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.5 Effect of OD600nm(initial cell density) on the activity of β-CGTase

2.2.2 初始培養(yǎng)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響

在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH 7.0）中按1%接種量接入種子液后，菌體分別在28、30、32、35、37 ℃，250 r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌濃OD600nm值分別達(dá)到1.0 時(shí)，將溫度均調(diào)至42 ℃誘導(dǎo)6 h后取樣處理測定酶活力，結(jié)果如圖6所示。初始培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)酶活力最高，之后隨著培養(yǎng)溫度升高酶活力迅速下降?？赡苁且?yàn)榇藭r(shí)的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)溫度之間溫差較大從而有利于重組酶的誘導(dǎo)合成所致；隨著初始培養(yǎng)溫度的升高，溫差逐漸減小，產(chǎn)酶量也隨之下降，較低的培養(yǎng)溫度不利于菌體的生長，所以酶的表達(dá)量不高。

圖6 初始培養(yǎng)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.6 Effect of initial culture temperature on the activity of β-CGTase

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)β-CGTase酶活力的影響

在50mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）中按1%接種量接入種子液后，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌濃OD600nm值均達(dá)到1.0時(shí)，將溫度調(diào)節(jié)到42 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后取樣處理測定酶活力，結(jié)果如圖7所示。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值較低時(shí)酶活力隨pH值的升高而增大，在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大，之后降低。由此可知，偏堿性環(huán)境較適合工程菌產(chǎn)酶，強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件對(duì)工程菌產(chǎn)酶有抑制作用。

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pHH值對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.7 Effect of initial medium pH on the activity of β-CGTase

2.2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響

圖8 誘導(dǎo)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.8 Effect of induction temperature on the activity of β-CGTase

在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH 8.0）中按1%接種量接入種子液后，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí)，分別在39、40、41、42、43℃條件下誘導(dǎo)6h后取樣處理測定酶活力，結(jié)果如圖8所示。42℃誘導(dǎo)最適合工程菌產(chǎn)酶，較高溫度則不利于產(chǎn)酶。這與載體pBV220自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，該載體含有編碼對(duì)PL啟動(dòng)子有抑制作用而又對(duì)溫度敏感的cI蛋白基因cIts857，該基因在30 ℃時(shí)具有抑制啟動(dòng)子的活性，而在42℃時(shí)失活從而失去抑制啟動(dòng)子的活性，此時(shí)的啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的起始RNA轉(zhuǎn)錄的功能，因此，此溫度下誘導(dǎo)表現(xiàn)出較高的酶活力。

2.2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)β-CGTase酶活力的影響

圖9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.9 Effect of induction time on the activity of β-CGTase

在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH 8.0）中按1%接種量接入種子液后，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí)，42 ℃分別誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7h后取樣處理測定酶活力，結(jié)果如圖9所示。誘導(dǎo)4 h時(shí)產(chǎn)酶量最高，延長誘導(dǎo)時(shí)間則不利于產(chǎn)酶。誘導(dǎo)時(shí)間與溫控啟動(dòng)子有關(guān)，許多研究表明，該表達(dá)載體在42 ℃的最佳誘導(dǎo)時(shí)間是4 h。如徐礪瑜等[19]研究利用溫控表達(dá)載體pBV220，在42 ℃對(duì)外源基因dhaB及yqhD進(jìn)行熱擊誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，獲得了較高活力的酶。誘導(dǎo)時(shí)間較短，啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄功能較低；延長誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌生長不利，因此都表現(xiàn)出較低的酶活力。

2.2.6 溫度梯度誘導(dǎo)對(duì)β-CGTase酶活力的影響

表1 溫度梯度誘導(dǎo)對(duì)β-CGTase酶活力的影響Table1 Effect of induction at gradient temperatures on the activity of β-CGGTTaassee

在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基（pH 8.0）中按1%接種量接入種子液后，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí)，溫度梯度設(shè)為：39、40、41、42 ℃。誘導(dǎo)4 h后測酶活力。由表1可知，溫度梯度誘導(dǎo)有利于工程菌產(chǎn)酶。最佳誘導(dǎo)溫度的分配為：39 ℃誘導(dǎo)0.5 h，40 ℃誘導(dǎo)0.5 h，41 ℃誘導(dǎo)1 h，42 ℃誘導(dǎo)2 h。此時(shí)酶活力高于42 ℃直接誘導(dǎo)4 h的活力，是由于直接誘導(dǎo)時(shí)溫度的變化一是使得菌體的生長壓力突然增加不利于菌體生長；二是蛋白基因cIts857突然失活，導(dǎo)致啟動(dòng)子的抑制作用突然消失，在短時(shí)間內(nèi)合成大量的重組蛋白，由于合成速度太快導(dǎo)致重組蛋白未能正確折疊，形成較多的包涵體，所以表現(xiàn)出較低的酶活力。

3 討 論

本研究通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將從土壤中篩選的Bacillus cereus strain LGQ01的β-CGTase基因克隆到溫控型表達(dá)載體pBV220中，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，獲得表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌。SDS-PAGE結(jié)果顯示，除了目的蛋白外，還含有一些其他雜蛋白，但目的蛋白表達(dá)量最多，分子質(zhì)量為70kD，與Zhou Yi等[20]報(bào)道的一致，與Petrova[12]和Lee[13]等報(bào)道的相近。通過對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究表明，該酶能在溫控原核表達(dá)體系中獲得高效表達(dá)。這對(duì)該酶的大規(guī)模發(fā)酵具有重要意義。

本研究所采用的表達(dá)載體pBV220長度為3 666 bp，選擇性標(biāo)記為Amp抗性，不僅具有串聯(lián)的PL和PR啟動(dòng)子，可以增強(qiáng)其啟動(dòng)作用；而且含有編碼對(duì)PL啟動(dòng)子有抑制作用而又對(duì)溫度敏感的cI蛋白基因cIts857調(diào)控基因cI，因此可用溫度對(duì)插入其中的外源基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。與T7誘導(dǎo)啟動(dòng)子相比，溫控誘導(dǎo)不需要額外添加IPTG誘導(dǎo)劑，不僅操作簡單，而且無毒無害，價(jià)格低廉，因此在本研究的基因工程產(chǎn)品工業(yè)化時(shí)，溫控啟動(dòng)子比誘導(dǎo)啟動(dòng)子有其明顯的優(yōu)越性和現(xiàn)實(shí)意義。

通過對(duì)工程菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，酶活力由優(yōu)化前的445 U/mL提高到956 U/mL，酶活力提高了1.15 倍，得到最佳產(chǎn)酶條件為：OD600nm值達(dá)到1.0，工程菌最初培養(yǎng)溫度30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.0、梯度誘導(dǎo)39 ℃培養(yǎng)0.5 h，40 ℃培養(yǎng)0.5 h，41 ℃培養(yǎng)1 h，42 ℃培養(yǎng)2 h。溫度梯度誘導(dǎo)比直接誘導(dǎo)效率高，酶活力提高了20%，原因是梯度誘導(dǎo)不利于包涵體的形成。本研究構(gòu)建的溫控型工程菌在高溫誘導(dǎo)下表現(xiàn)出較高的水解酶活力，而目前報(bào)道的工程菌表達(dá)量都不高[21]，并且大都是IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，生產(chǎn)成本高且IPTG不易去除；何飛燕等[22]建立以酚酞作指示劑，在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上篩選環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)突變株的平板快速篩選法，從土壤分離物中篩選到l株葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌gxmfl，37 ℃、250 r/min搖床發(fā)酵3 d，產(chǎn)酶活力為1 524 U/mL。曹新志等[23]對(duì)l株產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的嗜堿芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)酵液的酶活可達(dá)5 400 U/mL左右。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的溫控型工程菌產(chǎn)酶活力雖然低于這些野生菌產(chǎn)酶活力，但由于該工程菌具有產(chǎn)酶周期明顯較短的優(yōu)勢，因此該酶是有望在β-環(huán)糊精的酶法制備工業(yè)化生產(chǎn)中得到應(yīng)用的。但還需進(jìn)一步對(duì)異源高效表達(dá)的條件進(jìn)行研究，提高重組酶活力，使該工程菌能夠產(chǎn)業(yè)化，真正為國民經(jīng)濟(jì)服務(wù)。

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Construction of Temperature-Regulated Recombinant Escherichia coli for β-CGTase Expression and Optimization of Culture Conditions

FAN Ning, ZHANG Hong-bin*, LING Kai, LING Guo-qing, HU Xue-qin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The β-CGTase gene from Bacillus cereus was cloned in pBV220 plasmid after PCR amplification. The recombinant plasmid was transformed into E. coli DH5α. After ampicillin-resistance screening and restriction enzyme digestion analysis, we acquired recombinant E. coli DH5α/pBVcgt. The optimum fermentation conditions in shaking flask were acquired as follows: OD600nm= 1.0, initial culture temperature 30 ℃, initial medium pH 8.0, and gradient-temperature induction at 39 ℃ for 0.5 h followed by 40 ℃ for 0.5 h, 41 ℃ for 1 h and 42 ℃ for 2 h. The activity of β-CGTase under these fermentation conditions was increased from 445 to 956 U/mL, representing a 2.15-fold increase compared to that obtained before optimization. Cloning and expression of the β-CGTase gene showed that this enzyme could be expressed highly in E. coli expression system. Therefore, this study proves the possibility of protein engineering of β-CGTase for largescale production of β-CD.

Bacillus cereus; β-cyclodextrin glucanotransferase; engineered bacteria; expression; culture conditions

Q814

A

1002-6630（2014）11-0155-05

10.7506/spkx1002-6630-201411031

2014-02-13

安徽省自主創(chuàng)新專項(xiàng)（2013AKKG0391）

凡寧（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：fanning56789@163.com

*通信作者：張洪斌（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘づc酶工程。E-mail：hbzhang@hfut.edu.cn