紅發(fā)夫酵母中3R,3’R-蝦青素的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

孫偉紅，林 洪*，翟毓秀，冷凱良，邢麗紅

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

紅發(fā)夫酵母中3R,3’R-蝦青素的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

孫偉紅1,2，林 洪1,*，翟毓秀2，冷凱良2，邢麗紅2

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

研究紅發(fā)夫酵母中3R,3’R-蝦青素的分離純化工藝條件，并利用高效液相色譜串聯(lián)大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization- mass spectrometry，HPLCAPCI-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和高效液相色譜-紫外光譜（high performance liquid chromatography-ultra violet，HPLC-UV）對(duì)純化得到的蝦青素結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：利用細(xì)胞玻璃研磨器進(jìn)行研磨提取、硅膠柱層析分離和結(jié)晶提純相結(jié)合的方法，能夠有效減少反式蝦青素的異構(gòu)化，得到的蝦青素純度高于95%。采用高效液相色譜-質(zhì)譜儀（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）、超導(dǎo)核磁共振譜儀（1H和13C NMR）以及Chiralpak IC手性固定化纖維柱分析，顯示制備的反式蝦青素幾乎都以3R,3’R結(jié)構(gòu)組成。

紅發(fā)夫酵母；3R,3’R-蝦青素；分離；純化；結(jié)構(gòu)鑒定

蝦青素（astaxanthin），分子式為C40H52O4，是動(dòng)物界中分布最廣泛的一種類(lèi)胡蘿卜素。蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化性能，其還原能力是VE的幾百倍以上，有“超級(jí)VE”之稱。此外，它還具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)、抑制多元不飽和脂肪酸的氧化、抵御紫外線的作用、替代VA活性、增強(qiáng)人體免疫功能、改善視力、色素形成和神經(jīng)連通以及改善生育等的作用，同時(shí)還有清除二氧化氮、硫化物、二硫化物和降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用[1-4]。

紅發(fā)夫酵母（Phaff a rhodozyma）被認(rèn)為是除雨生紅球藻外最為合適的蝦青素來(lái)源[5]。紅發(fā)夫酵母屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetous）的紅發(fā)夫酵母屬，1976年Andrews等[6]發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生蝦青素，紅發(fā)夫酵母中蝦青素的含量是甲殼類(lèi)動(dòng)物蝦青素含量的5～50 倍，是雨生紅球藻的1%～10%。但酵母內(nèi)蝦青素的積累也受發(fā)酵時(shí)各種環(huán)境因子的影響，會(huì)隨發(fā)酵培養(yǎng)基的改變而改變，受溫度、pH值、溶氧、碳氮源等的影響也比較大。如果在菌株選育等方面能有所突破，勢(shì)必會(huì)帶來(lái)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力。

蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由4 個(gè)異戊二烯單位以共軛雙鍵形式聯(lián)結(jié)，兩端又有2 個(gè)異戊二烯單位組成6 節(jié)環(huán)結(jié)構(gòu)。因?yàn)楹幸粋€(gè)長(zhǎng)的共軛雙鍵系統(tǒng)，其穩(wěn)定性差。全反式蝦青素在3和3’位置有2 個(gè)不對(duì)稱碳原子，能以3 種構(gòu)象（光學(xué)異構(gòu)體）存在，包括一對(duì)對(duì)映體（3S,3’S；3R,3’R）和內(nèi)消旋形式（3R,3’S）。不同生物來(lái)源蝦青素的異構(gòu)體的比例不同[7]，酵母中的蝦青素98.5%以3R,3’R全反式結(jié)構(gòu)存在[8]。

對(duì)于紅發(fā)夫酵母的分離純化，國(guó)內(nèi)外已有一些研究，郭建瑞等[9]采用硅膠為吸附劑，石油醚-乙酸乙酯混合液為洗脫劑從粗色素油中分離純化蝦青素，但是該方法沒(méi)有制備蝦青素的晶體，對(duì)蝦青素純度的測(cè)定方法也不夠準(zhǔn)確；Lim等[10]研究了用超臨界萃取方法從紅法夫酵母提取蝦青素的條件，酵母經(jīng)破壁后分別用分子篩法和噴霧干燥法進(jìn)行干燥，蝦青素的產(chǎn)率為90%。但是，由于蝦青素在提純過(guò)程中容易受到光、熱等的影響發(fā)生異構(gòu)化，所以目前的提純方法難以得到3R,3’R全反式結(jié)構(gòu)的蝦青素純品。本研究通過(guò)改進(jìn)破壁等提取方法，以及層析分離和純化技術(shù)的優(yōu)化，制備了3R,3’R結(jié)構(gòu)的蝦青素純品，同時(shí)對(duì)其純度和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，為深入研究3R,3’R結(jié)構(gòu)蝦青素的作用機(jī)制，以及應(yīng)用于功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅發(fā)夫酵母粉（蝦青素含量約為0.35%）購(gòu)自青島森淼實(shí)業(yè)有限公司；全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為（95.8±0.5）%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

硅膠（300～400目）、丙酮、正己烷、異丙醇、乙腈、甲醇、二氯甲烷和叔丁基甲基醚等均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；AVANCEⅡ600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；TSQ Quantum Access液相色譜-高分辨串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有大氣壓力化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源） 美國(guó)Thermo公司；HL-S恒流泵 上海瀘西分析儀器廠；玻璃層析柱（4cm×50cm） 上海楚定分析儀器有限公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；Turbo VapⅡ型吹氮濃縮儀 美國(guó)Caliper公司；L-550臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；YMC-Carotenoid C30色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本YMC公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制Milli-Q超純水 美國(guó)Millipore公司。

加工誤差指機(jī)床加工過(guò)程中刀具實(shí)際路徑與設(shè)計(jì)理想位置之間的尺寸偏差。加工誤差影響新加工出來(lái)的零件特征，用零件特征的局部坐標(biāo)系相對(duì)于機(jī)床坐標(biāo)系的偏差表示。

1.3 方法

1.3.1 蝦青素測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]中的方法，色譜柱為YMC-Carotenoid C30色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為叔丁基甲基醚，流動(dòng)相C為1%體積的磷酸溶液；洗脫梯度為：81%A、15%B、4%C（0 min）；66%A、30%B、4%C（15 min）；16%A、80%B、4%C（23 min，保持至27 min）；81%A、15%B、4%C（30 min）。流速為1.0 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為474 nm；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫：室溫。

1.3.2 蝦青素的提取

每次加入約500 mg酵母粉于細(xì)胞玻璃研磨器中，并加入少量丙酮充分研磨，將提取液超聲提取5 min，5℃、10 000 r/min離心5 min，收集紅色提取液。重復(fù)提取酵母渣3 次，合并提取液。采用此方法提取約5 g酵母粉，收集約400 mL提取液。經(jīng)液相測(cè)定，提取液中游離蝦青素全部為全反式結(jié)構(gòu)。

1.3.3 蝦青素的純化

采用4 cm×50 cm層析柱，加入80 g硅膠（經(jīng)120 ℃活化60 min，正己烷浸泡過(guò)夜后濕法裝柱），高度為40 cm，正己烷平衡柱子，將提取液真空濃縮至約5mL后上柱，加入正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1，V/V）洗脫，流速為0.5 mL/min，棄掉開(kāi)始流出的約1 000 mL餾分（脂類(lèi)等雜質(zhì)峰稍多），收集剩余的紅色洗脫液，經(jīng)液相測(cè)定，游離蝦青素含量高于75%。

室溫下將提取液真空濃縮至干，加入約100 mL丙酮溶解，轉(zhuǎn)移到具塞三角瓶中，于氮?dú)庀麓祾?，使達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，并有少量紅棕色晶體生成，加入幾滴蒸餾水，在4 ℃左右下低溫析晶72 h，收集晶體后先后用蒸餾水和丙酮清洗兩次，真空低溫凍干。經(jīng)測(cè)定，晶體純度為95%。

1.3.4 蝦青素的手性確證

參照Wang等[12]的方法稍作改進(jìn)，正相系統(tǒng)，Chiralpak IC 手性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為叔丁基甲醚-乙腈（50∶50，V/V），流速為1.0 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為476 nm；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫：室溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅發(fā)夫酵母提取方法的優(yōu)化

紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞壁較厚，有效的破壁方法對(duì)蝦青素的有效提取非常重要。常用的破壁方法包括微波法[13]、低溫研磨萃取法、有機(jī)溶劑萃取法和低溫研磨法[14]等，其中低溫研磨法是比較常用的破壁方法。但是在操作中發(fā)現(xiàn)，研缽在低溫研磨時(shí)可能會(huì)破裂，而且用溶劑轉(zhuǎn)移時(shí)容易造成損失。最終，該方法采用了細(xì)胞玻璃研磨器進(jìn)行有機(jī)溶劑研磨提取，方法方便、快速、高效，而且可以有效減少蝦青素的異構(gòu)化。

在常溫下，蝦青素在有機(jī)溶劑中的溶解度不同[15]，二氯甲烷>氯仿>乙腈>丙酮，但是反式結(jié)構(gòu)的蝦青素在有機(jī)溶劑中容易轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu)，異構(gòu)化率的大小與溶劑有關(guān)，二氯甲烷>氯仿>甲醇>丙酮，而且溫度的升高能夠加快異構(gòu)化的進(jìn)程[16]。雖然二氯甲烷的溶解度最大，但是異構(gòu)化率也最高，為了減少標(biāo)準(zhǔn)品制備中順式結(jié)構(gòu)的干擾，選擇了丙酮作為提取溶劑。

圖1 紅發(fā)夫酵母提取物的色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of Phaff a rhodozyma extract

蝦青素在紅發(fā)夫酵母中主要以游離態(tài)存在，由圖1可知，提取液中全反式蝦青素含量較高，還有少量脂類(lèi)等雜質(zhì)存在，需要進(jìn)行進(jìn)一步純化。

2.2 柱層析分離

分離蝦青素與其他色素和酯類(lèi)，可以利用酚羥基對(duì)陽(yáng)性基團(tuán)的吸附，實(shí)現(xiàn)蝦青素與其他化合物的分離，然后通過(guò)解吸附來(lái)分離蝦青素。當(dāng)提取物中含有胡蘿卜素和脂類(lèi)等雜質(zhì)時(shí)，通常采用硅膠作為固定相對(duì)色素進(jìn)行凈化[17]，而一定比例組成的極性和非極性混合溶劑適合作為洗脫溶劑。本研究對(duì)層析柱規(guī)格、硅膠的添加量、洗脫溶劑和餾分中蝦青素的含量進(jìn)行了確定。參考劉莉娜等[18]對(duì)法夫酵母中蝦青素的提純方法，在實(shí)驗(yàn)中選擇了300～400 目的硅膠，對(duì)層析柱的規(guī)格（3 cm×30 cm、4 cm×50 cm、5.5 cm×60 cm）、硅膠用量（40、80、120 g）和洗脫溶劑（正己烷、正己烷-丙酮（7∶3，V/V）、正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1，V/V））進(jìn)行了選擇。3 cm×30 cm層析柱上樣量小、分離效果差，而5 cm×60 cm層析柱洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，只有4 cm×50 cm層析柱的分離效果和洗脫時(shí)間均能滿足要求。硅膠用量也與上樣量、洗脫時(shí)間和分離效果有關(guān)，依據(jù)文中的上樣量，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，硅膠填充量以80 g為宜。洗脫溶劑的選擇要依據(jù)溶劑極性和它們的混溶性，以及溶劑對(duì)被分析物的溶解性，以及被分析物的結(jié)構(gòu)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1）的洗脫時(shí)間、分離度和樣品得率均優(yōu)于其他試劑。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定層析柱規(guī)格為4 cm×50 cm，硅膠填充量為80 g，正己烷：二氯甲烷：丙酮（5∶2.5∶1，V/V）作為洗脫溶劑。在實(shí)驗(yàn)中分段收集最上層紫紅色色帶上洗脫下來(lái)的溶液，測(cè)定蝦青素純度和含量，只收集并濃縮純度大于75%的洗脫液。

2.3 結(jié)晶提純

溶液結(jié)晶常被用作固體材料的分離提純過(guò)程。為了提高產(chǎn)率，增加晶體的純度，需要優(yōu)化結(jié)晶過(guò)程的各項(xiàng)參數(shù)。蝦青素在有機(jī)溶劑中容易異構(gòu)化，綜合考慮其在不同溶劑中的異構(gòu)化率和溶解度（在丙酮中溶解度為0.2 g/L）[15]，選擇丙酮作為結(jié)晶溶劑。由于蝦青素不溶于水相溶劑，加入少量水能夠促進(jìn)溶析結(jié)晶，所以該方法采用了水析結(jié)晶的方式，得到的晶體晶形好，不易包藏母液，最后采取少量水和丙酮清洗晶體表面，更有利于清除母液和雜質(zhì)?？紤]到蝦青素不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，整個(gè)結(jié)晶過(guò)程應(yīng)保持充氮避光和低溫環(huán)境下，太低的溫度下晶體析出快，不利于純化，而4 ℃左右的溫度條件可以促使晶體較快析出，通過(guò)液相色譜儀測(cè)定，制備的晶體經(jīng)低溫凍干后得到的純度大于95%。此外，結(jié)晶過(guò)程不能太長(zhǎng)，72 h左右是比較理想的結(jié)晶時(shí)間能夠保證得到較多的晶體，并能減少異構(gòu)化的影響。

2.4 3R,3’R-蝦青素的鑒定

將制備的化合物進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定，在正離子模式下采用APCI源對(duì)其主要結(jié)構(gòu)信息和裂解規(guī)律進(jìn)行分析，具有下列3 個(gè)主要特征峰：597（M+）、579（[M-18]+）、561（[M-36]+），m/z 579和561均是母體分子失去水所產(chǎn)生的碎片離子，這說(shuō)明其分子質(zhì)量和裂解規(guī)律與蝦青素相同。

為了進(jìn)一步證明化合物的構(gòu)型，應(yīng)用600 MHz1H NMR進(jìn)行了光譜測(cè)定，全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品和酵母提純樣品的1H NMR 和13C-NMR圖見(jiàn)圖2、3。經(jīng)解譜，樣品1H NMR和13C NMR的解譜結(jié)果與反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品完全一致，可以說(shuō)明制備化合物為反式蝦青素。

圖2 全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR（aa）和1313C-NMR（b）圖Fig.2 1H NMR (a) and13C NMR (b) of all-trans-astaxanthin standard in CDCL3

圖3 紅發(fā)夫酵母中提取的蝦青素的1H NMR（aa）和13C-NMR（b）圖Fig.3 1H NMR (a) and13C NMR (b) of all-trans-astaxanthin from Phaff a rhodozyma in CDCL3

目前測(cè)定蝦青素光學(xué)異構(gòu)體比例的方法是基于相應(yīng)的非對(duì)映體的分離，可以采用Chiralpak IC手性固定化纖維柱對(duì)全反式蝦青素的3種光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離。圖4是全反式蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的色譜圖，合成蝦青素異構(gòu)體的3R,3’R∶3R,3’S∶3S,3’S比例為1∶2∶1，紅發(fā)夫酵母中提取的反式蝦青素幾乎都以3R,3’R結(jié)構(gòu)組成。

圖4 合成蝦青素（a）和紅發(fā)夫酵母中提純的蝦青素（b）的光學(xué)異構(gòu)色譜圖Fig.4 Chromatographic separation of all-trans-astaxanthin isomeric mixture from synthetic all-trans-astaxanthin (a) compared with that derived from Phaff a rhodozyma (b)

3 結(jié) 論

本研究以紅發(fā)夫酵母為原料，利用硅膠柱層析和結(jié)晶提純對(duì)蝦青素進(jìn)行了分離、純化并對(duì)得到的蝦青素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)論如下：1）利用本方法可以制備純度高于95%的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品；2）樣品1H NMR和13C NMR的解譜結(jié)果與反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品完全一致，可以說(shuō)明制備化合物為反式蝦青素；3）通過(guò)Chiralpak IC手性固定化纖維柱的分離，確定紅發(fā)夫酵母中提取的反式蝦青素幾乎都以3R,3’R結(jié)構(gòu)組成。

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Separation, Purification and Identification of (3R,3’R)-trans-Astaxanthin from Phaff a rhodozyma

SUN Wei-hong1,2, LIN Hong1,*, ZHAI Yu-xiu2, LENG Kai-liang2, XING Li-hong2
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

The separation and purification of (3R,3’R)-trans-astaxanthin from Phaffia rhodozyma were studied, and the 3R,3’R isomers were characterized by HPLC-APCI-MS,1H and13C NMR and HPLC-UV. The results showed that the isomerization of trans-astaxanthin was effectively inhibited by combined use of glass tissue grinder for extraction, lowpressure silica gel column chromatography for separation and crystallization of supersaturated astaxanthin in acetone for purification, and the purity of all-trans-astaxanthin crystalline powder was verified to be above 95% by using HPLC. Then, HPLC-APCI-MS,1H and13C NMR and chiralpak IC column based on cellulose tris(3,5-dichlorophenyl carbamate) polymer confirmed that the trans-astaxanthin was composed almost exclusively of 3R,3’R isomer.

Phaff a rhodozyma; (3R,3’R)-trans-astaxanthin; separation; purification; identification

TS202.3

A

1002-6630（2014）11-0079-04

10.7506/spkx1002-6630-201411016

2013-07-10

孫偉紅（1977—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全性與質(zhì)量控制。E-mail：sunwh@ysfri.ac.cn

*通信作者：林洪（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全性與質(zhì)量控制。E-mail： linhong@ouc.edu.cn