亞甲基藍(lán)對單增李斯特菌菌膜的光動力殺傷作用

李紅愛，唐姝姝，劉永強(qiáng)，鄧 曦，唐書澤,*，吳希陽，陳振強(qiáng)

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.廣州皇上皇集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 510240）

亞甲基藍(lán)對單增李斯特菌菌膜的光動力殺傷作用

李紅愛1，唐姝姝1，劉永強(qiáng)2，鄧 曦1，唐書澤1,*，吳希陽1，陳振強(qiáng)1

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.廣州皇上皇集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 510240）

探討單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）生物菌膜的生長特性及亞甲基藍(lán)對LM生物菌膜光動力殺傷作用。通過結(jié)晶紫染色法判斷與觀察LM生物菌膜的形成并用酶標(biāo)儀在595 nm波長處對其不同生長階段的生物量進(jìn)行測定，同時(shí)通過細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)法研究亞甲基藍(lán)對LM生物菌膜的光動力殺傷作用。結(jié)果表明：結(jié)晶紫染色法可用于定性判斷與觀察LM生物菌膜，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，LM生物菌膜生物量不斷增加，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越來越致密。當(dāng)光敏劑質(zhì)量濃度為10 μg/mL的亞甲基藍(lán)在光功密度為200 mW/cm2的可見光照射30 min時(shí)，即可使LM生物菌膜的失活率達(dá)到99.99%以上，其菌落數(shù)降低了4.08（lg（CFU/mL））。亞甲基藍(lán)對LM生物菌膜的光動力滅活作用非常顯著，其殺傷效果主要取決于光敏劑質(zhì)量濃度和光照時(shí)間。

生物菌膜；單增李斯特菌；亞甲基藍(lán)；光動力滅菌技術(shù)

自然界中各種微生物并非僅以單個(gè)的浮游菌（planktonic）存在，主要是以生物菌膜（biofilm，BF）形式生存[1-2]。BF是指細(xì)菌在適宜條件下附著于介質(zhì)表面并不斷增殖形成復(fù)雜膜狀結(jié)構(gòu)，主要由吸附的細(xì)菌及其分泌的胞外多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成的細(xì)菌群落[3-4]。相比于浮游狀態(tài)的細(xì)菌，BF具有更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及較強(qiáng)的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[5-6]，其對常用滅菌方法（如熱殺菌、生物殺菌劑、輻射殺菌等）有更強(qiáng)的抵抗能力[7-8]且難以被徹底清除[9]。因此，病原微生物一旦在食品加工設(shè)備表面吸附、形成BF后，受到加工污染的食品，滅菌將變得更加困難，從而影響食品安全[10]。研究認(rèn)為，在食品加工環(huán)境中形成BF的主要食品致病菌是單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）[10-11]。LM是最重要的食源性致病菌之一，已引發(fā)多起食源性疾病[12]，臨床死亡率高達(dá)20%～30%[13]。即食肉制品、家禽制品及冷藏冷凍食品極易受LM的污染[14]，導(dǎo)致潛在食物中毒。

光動力滅菌技術(shù)（anti-microbial photodynamic technology，APDT）是利用光敏劑對活性細(xì)菌的優(yōu)先聚集特性，在特定波長的光照射激發(fā)下，光敏劑吸收能量產(chǎn)生單線態(tài)氧、自由基等活性氧物質(zhì)，再通過氧化作用滅活細(xì)菌，而不傷害周圍組織和細(xì)胞的殺菌技術(shù)[15]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)APDT對曲霉孢子[16]、蠟樣芽孢桿菌[17]、金黃色葡萄球菌[18]、沙門氏菌[19]、LM[20]及大腸桿菌O157[21]等浮游菌具有顯著的殺菌效果。

亞甲基藍(lán)是一種溶于水中具有陽性電荷的堿性染料，基于其高濃度時(shí)仍對人類的低毒性而被廣泛應(yīng)用于新鮮冷凍血漿中病毒的光滅活研究[22]。本實(shí)驗(yàn)選用LM菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19111作為實(shí)驗(yàn)菌株，對LM生物菌膜的形成過程進(jìn)行觀察并以亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）作為光敏劑，探討MB-APDT對LM生物菌膜的殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

LM標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19111 廣州市微生物研究所。

細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

亞甲基藍(lán) 上海紅綠光敏劑研究所有限公司；結(jié)晶紫 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；75 W溴鎢燈（光功密度200 mW/cm2） 北京卓立漢光儀器有 限公司；MK3酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾；雙目型XSP-2CA顯微鏡 上海團(tuán)結(jié)儀器制造有限公司。

1.3 菌種培養(yǎng)及前處理

將活化的 LM 接種于5 mL胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期（約12～14 h）；以4 500 r/min離心10 min，棄上清液，重新懸浮菌體于0.1 mol/L、pH 7.4的無菌磷酸緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）中，調(diào)整其 OD600nm值為0.4左右 （約為108CFU/mL）。

1.4 LM生物菌膜形成的判定與檢測

1.4.1 結(jié)晶紫染色法觀察LM生物菌膜

在96孔平底板中加入200 μL LB肉湯培養(yǎng)基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）[23]，再加入10 μL已制備的菌懸液，在37 ℃培養(yǎng)48 h，吸出菌懸液，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；加200 μL 0.5%的結(jié)晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出，自然干燥，拍照。同時(shí)，做空白對照組（不加菌懸液培養(yǎng)）。

在6孔平底板（放置了18 mm×18 mm的載玻片）中加入5 mL LB肉湯培養(yǎng)基（含0.45 g/100 mL的葡萄糖），再加入50 μL菌懸液，在37 ℃分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，小心取出載玻片，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；用10%甲醇固定10 min，再加0.5%結(jié)晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出，自然干燥，置顯微鏡下觀察。同時(shí)，做空白對照組（不加菌懸液培養(yǎng)）。

1.4.2 96孔酶標(biāo)板制備LM生物菌膜及其生物量的測定

取10 μL處理好的菌懸液接種到已加有200 μL LB肉湯培養(yǎng)基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）的96孔平底酶標(biāo)板中，分別在37 ℃培養(yǎng)0、4、8、12、24、48、72、96、120 h，按如下操作[24]：吸出菌懸液，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；加 200 μL 0.5%的結(jié)晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出；再用95%乙醇溶解5 min，酶標(biāo)儀于595 nm波長處測其光密度值。同時(shí)，做空白對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。用OD595nm值反映生物量的大小。

1.5 APDT對LM生物菌膜的滅活實(shí)驗(yàn)

1.5.1 MB質(zhì)量濃度對LM生物菌膜失活率和菌落數(shù)的影響

取10 μL制備的菌懸液接種到有200 μL LB肉湯培養(yǎng)基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）的96孔板中，在37 ℃培養(yǎng)24 h，吸出菌懸液，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；加入不同質(zhì)量濃度的MB（0、0.01、0.1、1、10、50 μg/mL），37 ℃避光孵育30 min，將96孔板放置于溴鎢燈光前20 cm處，照射30 min。光照組用L＋表示，同時(shí)設(shè)置對照組（不光照組：L－）。

1.5.2 光照時(shí)間對LM生物菌膜失活率和菌落數(shù)的影響

LM生物菌膜處理同1.4.1節(jié)，加入1 μg/mL MB，37 ℃避光孵育30 min，將96孔板放置于溴鎢燈光源前20 cm處，分別照射0、5、10、20、30 min。光敏劑組用S＋表示，同時(shí)設(shè)置對照組（不加光敏劑組：S－）。

1.5.3 細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)

按照1.4.1、1.4.2節(jié)不同方式處理后，將96孔杯放入超聲振蕩儀中，振蕩（2.5×104Hz）30 s，間隔30 s，重復(fù)3次，使得生物菌膜完全從96孔杯壁及底部脫落下來，分散于菌懸液中。將所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋，各取100 μL梯度稀釋液涂板于細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，48 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

式中：N對照組菌落數(shù)/（CFU/mL）；n為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)晶紫染色法判定LM生物菌膜的形成

圖1A表示在96孔酶標(biāo)板中培養(yǎng)LM生物菌膜，用結(jié)晶紫染色后能清楚地看到被染上紫色的環(huán)，即為生物菌膜，無紫色環(huán)的孔杯為空白對照組。圖1B～E表示在載玻片上培養(yǎng)且經(jīng)過結(jié)晶紫染色后用顯微鏡觀察的LM生物菌膜照片，其中，圖1B為培養(yǎng)0 h，即空白載玻片觀察到的圖片，無紫色的菌體；圖1C一部分菌株相連且呈較稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；圖1D相比培養(yǎng)24 h 的生物菌膜，相連菌株數(shù)量明顯增多且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更密集；圖1D可見大量菌株相連且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密。LM生物菌膜結(jié)晶紫染色法觀察結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，從浮游菌到生物菌膜是一個(gè)菌體數(shù)量由少到多，菌膜結(jié)構(gòu)由簡單到復(fù)雜的形成過程，這與已有研究報(bào)道結(jié)果基本一致，Lizcano等[25]對肺炎鏈球菌BF的形成研究表明，BF形成初期只有薄薄的一層；培養(yǎng)中期菌體數(shù)大量增加形成“地毯”；后期BF形成厚厚的融合層，部分菌體聚集成團(tuán)。

圖1 結(jié)晶紫染色法觀察LLMM的生物菌膜Fig.1 Formation of L.monocytogenes biofilms visualized by crystal violet staining

2.2 LM生物菌膜生物量變化

圖 2 LM生物菌膜培養(yǎng)120 h的光密度變化Fig.2 Optical density of L.monocytogenes biofilms during 120 h incubation

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，光密度不斷上升，即生物菌膜的生物量不斷增加。在最初的8 h，生物量增長速度最快；隨著生物菌膜不斷生成并趨向成熟，生物量增長平穩(wěn)。這也說明在生物菌膜形成過程中，菌體數(shù)量由少到多聚集，與2.1節(jié)的分析結(jié)果相吻合。

2.3 MB質(zhì)量濃度對LM生物菌膜光動力滅活作用的影響

由圖3可知，當(dāng)MB的質(zhì)量濃度低至0.01 μg/mL時(shí)，光照30 min，能夠使LM殺傷效果約為60%；當(dāng)MB質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，幾乎全部LM生物菌膜都被滅活，菌落數(shù)降低約7（lg（CFU/mL））。因此，在相同光照條件下，隨著MB質(zhì)量濃度的增加，光動力殺菌技術(shù)對LM生物菌膜的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。而光敏劑對照組和光照對照組均沒有明顯的滅活作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度MB對 LM生物菌膜失活率（A）和菌落數(shù)（B）的影響Fig. 3 Effect of MB concentration on inactivation rate (A) and colony counts (B) of L. monocytogenes biofilms

2.4 光照時(shí)間對LM生物菌膜APDT滅活作用的影響

圖4 不同光照時(shí)間對LM生物菌膜失活率（A）和菌落數(shù)（B）的影響Fig.4 Effect of illumination time on inactivation rate (A) and colony counts (B) of L. monocytogenes biofilms

由圖4可知，當(dāng)MB質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)，光照5 min即可使約80%的LM生物菌膜失活；當(dāng)光照時(shí)間為30 min時(shí)，可以使LM生物菌膜的失活率達(dá)到99.99%。表明當(dāng)MB質(zhì)量濃度一定時(shí)，APDT對LM生物菌膜的殺傷作用隨著光照時(shí)間的延長而增強(qiáng)。

本課題組前期研究[16-21]已經(jīng)證實(shí)APDT對浮游菌具有顯著的殺菌效果。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)APDT對于結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、對常用殺菌方法抵抗力更強(qiáng)的生物菌膜也有非常強(qiáng)的滅活作用。但相較于浮游的LM[20]，要達(dá)到相同的滅活效果，僅需要MB的質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL，同樣光源下光照10 min。即相對于浮游菌，使LM生物菌膜滅活需要更高濃度的光敏劑和更長的光照時(shí)間，也說明生物菌膜更難被消滅與控制。這與Buchovec等[26]的研究結(jié)果基本相似，以5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）為光敏劑對LM浮游菌及LM生物菌膜進(jìn)行光動力滅菌，生物菌膜所需的光敏劑質(zhì)量濃度比浮游LM使用的質(zhì)量濃度更高，光照時(shí)間更長。

3 結(jié) 論

結(jié)晶紫染色法可用于定性判斷與檢測單增李斯特菌生物菌膜的形成且能用于觀察其菌膜形成的狀況，此法簡單易行。在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，單增李斯特菌生物菌膜隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，其生物量不斷增加且菌膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得更為致密，此結(jié)果可用于解釋為什么生物菌膜比浮游菌更難消滅與控制，也為選擇滅活生物菌膜的更佳條件提供依據(jù)。光敏劑亞甲基藍(lán)質(zhì)量濃度為10 μg/mL在光功密度為200 mW/cm2的溴鎢燈下光照30 min，可使單增李斯特菌生物菌膜的失活率達(dá)到99.99%以上，其菌落數(shù)降低了4.08（lg（CFU/mL））。因此，亞甲基藍(lán)對單增李斯特菌生物菌膜有非常顯著的光動力滅活作用，其效果主要受光敏劑質(zhì)量濃度和光照時(shí)間的影響。光動力殺菌技術(shù)可作為一種有效的非熱生物菌膜滅活技術(shù)應(yīng)用于食品加工設(shè)備及食品加工環(huán)境中的消毒滅菌。

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Antimicrobial Photodynamic Activity of Methylene Blue against Listeria monocytogenes Biofilms

LI Hong-ai1, TANG Shu-shu1, LIU Yong-qiang2, DENG Xi1, TANG Shu-ze1,*, WU Xi-yang1, CHEN Zhen-qiang1
(1. College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Guangzhou Huangshanghuang Group Co. Ltd., Guangzhou 510240, China)

The formation of Listeria monocytogenes (LM) biofi lms (BF) and its photodynamic inactivation by methylene blue (MB) were investigated. The LM BF formation process was identifi ed by crystal violet staining, and the amount of biomass was tested with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate reader at 595 nm. The inactivation effect of MB on LM BF was verifi ed by counting colony-forming units (CFU). Res ults indicated that crystal violet staining could be used to visualize and quan tify LM BF. The amount of biomass increased and the formed network structure became more complicated as the incubation time was extended. Over 99.99% of LM BF was inactivated and colony-forming units were reduced by 4.08 (lg(CFU/mL)) after illumination with visible light (power density 200 mW/cm2) for 30 min. LM BF were effectively inactivated by MB, and the effi cacy mainly de pended on the concentration of photosesitizer and illumination time.

biofi lm (BF); Listeria monocytogenes (LM); methylene blue (MB); anti-microbial photodynamic technology (APDT)

TS207.3

A

1002-6630（2014）03-0144-04

10.7506/spkx1002-6630-201403029

2013-01-12

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2012010008479）；廣東省突發(fā)公共事件應(yīng)急技術(shù)研究中心專項(xiàng)（[2011]733）

李紅愛（1987—）， 女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?E-mail：lha_sunny@hotmail.com

*通信作者：唐書澤（1957—），男， 教授，博士后，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：tangsz@jnu.edu.cn