門靜脈高壓大鼠腸黏膜通透性改變時(shí)D-乳酸和內(nèi)毒素的表達(dá)及復(fù)合膳食纖維的保護(hù)作用

喬小東 武 華

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院普外科，山西太原 030001

門靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是臨床一種常見病、多發(fā)病，為各種原因所致門靜脈血循環(huán)障礙而導(dǎo)致的一系列臨床綜合征，病死率較高，影響患者的生命質(zhì)量，并對(duì)家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。其中門靜脈高壓性腸病[1]是其與腸道密切相關(guān)的臨床表現(xiàn)之一。 然而胃腸道又是體內(nèi)最大的細(xì)菌儲(chǔ)存器官[2]，腸屏蔽功能受損后引發(fā)的腸道菌群易位是其繼發(fā)感染及膿毒癥的主要原因[3]。 因此如何進(jìn)行腸屏蔽功能的檢測和保護(hù)將成為研究的重點(diǎn)。 有研究證明，復(fù)合膳食纖維在保持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、改善腸道黏膜功能方面發(fā)揮積極作用[4]。 本研究利用門靜脈高壓大鼠模型，通過對(duì)模型大鼠血漿D-乳酸和內(nèi)毒素表達(dá)的測定，探尋復(fù)合膳食纖維對(duì)門靜脈高壓大鼠腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雌性Wistar 大鼠65 只，體重180～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。 能全素（整蛋白型腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑，產(chǎn)品批號(hào)：121004）購自紐迪希亞制藥（無錫）有限公司。復(fù)合膳食纖維（可溶與不可溶性膳食纖維）購自無錫華瑞制藥有限公司。 D-乳酸試劑盒購自BioAssay Systems 公司。 鱟試劑盒（Ⅱ）購自上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 健康雌性Wistar 大鼠65 只經(jīng)0.35 g/L苯巴比妥溶液誘導(dǎo)1 周后，隨機(jī)抽取5 只大鼠設(shè)為對(duì)照組，其余60 只大鼠為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠采用50%的CCl4橄欖油復(fù)合法建立門靜脈高壓模型：以0.4 mL/100 g 的劑量經(jīng)背部皮下注射50%的CCl4橄欖油溶液，每周2 次，持續(xù)4 周；之后按0.5 mL/100 g 劑量同法注射，每周2 次，持續(xù)4 周，共8 周。第10 周隨機(jī)抽取2 只大鼠行門靜脈壓力測定及肝組織活檢。建模成功并存活的大鼠共40 只。 對(duì)照組大鼠以同法注射生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物分組 將40 只門靜脈高壓大鼠模型隨機(jī)分成A、B、C、D 4 組，每組各10 只，各組按125 mL/（kg·d）劑量分四次（8 h 1 次）給予不同的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑。 A組給予生理鹽水；B 組給予不含膳食纖維的能全素；C組給予能全素+復(fù)合膳食纖維20 g/L （可溶與不可溶之比為1∶2）；D 組給予能全素+復(fù)合膳食纖維20 g/L（可溶與不可溶之比為2∶1）。對(duì)照組行正常飼養(yǎng)，各組大鼠飼養(yǎng)期間自由飲水。

1.3 檢測指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)組4 組大鼠分別于飼養(yǎng)的第1、3、7 天中相同的時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取3、3、4 只大鼠行麻醉后開腹，使用采血針穿刺門靜脈取全血2 mL 置于肝素抗凝管內(nèi)，低溫離心后，吸取上清液，于-20℃保存；門靜脈取血后，行腹主動(dòng)脈穿刺，用加有肝素的試管留取血4～5 mL，低溫離心后，吸取上清液1 mL，于-20℃保存；在距盲腸10～12 cm 處剪取2 cm 末端回腸組織，在10%的中性甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋留作標(biāo)本。對(duì)照組大鼠于飼養(yǎng)的第7 天以同法取血及組織標(biāo)本。 取材后采用頸椎脫臼法處死相應(yīng)大鼠。

1.3.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 每只大鼠的石蠟標(biāo)本，以4 μm厚度垂直切片，經(jīng)HE 染色后在光鏡下觀察回腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.2 D-乳酸含量測定 采用改良的酶學(xué)分光光度法測定血漿中D-乳酸活性[5]。

1.3.3 血漿內(nèi)毒素測定 采用鱟試劑偶氮顯色法測定內(nèi)毒素濃度，過程嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組大鼠各時(shí)相回腸黏膜均出現(xiàn)明顯的黏膜萎縮，絨毛萎縮變短，黏膜固有層水腫，腺體排列稀疏，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，部分黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，黏膜下層充血水腫及出血顯著。 對(duì)照組回腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整。實(shí)驗(yàn)組中各時(shí)相B、C、D組均較A 組腸黏膜的損傷輕，其中B 組在7 d 時(shí)較同時(shí)相的A 組回腸黏膜的損傷有所改善，C、D 組在3 d和7 d 較同時(shí)相的B 組回腸黏膜的損傷有所改善但未能完全恢復(fù)至對(duì)照組水平。

2.2 各組血漿D-乳酸表達(dá)及含量

實(shí)驗(yàn)組四組大鼠血漿D-乳酸表達(dá)在建模后各時(shí)相與對(duì)照組[（2.13±0.39）mg/L]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），各組隨時(shí)間變化的曲線方向基本一致。 建模后1 d 四組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；3、7 d 四組組間比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），且3、7 d 各時(shí)相B、C、D 組大鼠血漿D-乳酸表達(dá)分別與A 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3、7 d 各時(shí)相C、D 組分別與B 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），各時(shí)相D 組與C 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠血漿D-乳酸測定結(jié)果（mg/L，±s）

表1 各組大鼠血漿D-乳酸測定結(jié)果（mg/L，±s）

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與C 組比較，&P <0.05

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2.3 各組血漿內(nèi)毒素表達(dá)及含量

實(shí)驗(yàn)組四組大鼠血漿內(nèi)毒素表達(dá)在建模后各時(shí)相與對(duì)照組[（0.21±0.02）EU/mL]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 建模后1 d 四組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；3、7 d 四組組間比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），且3、7 d 各時(shí)相B、C、D 組大鼠血漿內(nèi)毒素表達(dá)分別于A 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3、7 d 各時(shí)相C、D 組分別于B 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），各時(shí)相D組與C 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素測定結(jié)果（EU/mL，±s）

表2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素測定結(jié)果（EU/mL，±s）

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與C 組比較，&P <0.05

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3 討論

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障組成[6-8]。通過大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，在腸黏膜缺血、再灌注損傷、營養(yǎng)不良及應(yīng)激性損傷等原因下，均可引起腸黏膜損傷、萎縮、通透性增加、 菌群失調(diào)等表現(xiàn)的腸黏膜屏障功能障礙。腸屏障功能障礙可導(dǎo)致細(xì)菌和（或）內(nèi)毒素易位，并可誘發(fā)和（或）加重全身炎性反應(yīng)和多器官功能障礙[9]。

本研究通過對(duì)門靜脈高壓大鼠模型的回腸黏膜組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)血漿D-乳酸和內(nèi)毒素指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：①實(shí)驗(yàn)組門靜脈高壓大鼠模型的回腸黏膜有明顯的萎縮，絨毛萎縮變短，黏膜固有層水腫，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，部分黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，黏膜下層充血水腫及出血顯著。 而對(duì)照組回腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整。 提示腸黏膜屏障功能受損。②實(shí)驗(yàn)組門靜脈高壓大鼠模型的血漿D-乳酸和內(nèi)毒素的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，提示通過建立門靜脈高壓模型后大鼠腸黏膜明顯受損，腸黏膜屏障功能障礙。當(dāng)腸道發(fā)生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，腸黏膜通透性增加時(shí)，腸道中細(xì)菌產(chǎn)生大量D-乳酸通過受損黏膜入血，使血漿D-乳酸水平升高，故檢測血漿D-乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損害程度和通透性變化[10]。 正常情況下機(jī)體腸腔內(nèi)含有大量細(xì)菌和內(nèi)毒素，當(dāng)腸屏障功能障礙時(shí)，內(nèi)毒素通過腸黏膜，進(jìn)入血循環(huán)，形成內(nèi)毒素血癥，因此監(jiān)控外周血中的內(nèi)毒素水平，成為了解腸屏障功能的重要手段[11]。

腸內(nèi)營養(yǎng)在防止腸黏膜萎縮、維護(hù)腸黏膜機(jī)械及免疫屏障、防止細(xì)菌易位的發(fā)生其重要作用[12]。 膳食纖維是植物中的可食用部分或類似的碳水化合物，雖然不能在小腸內(nèi)被降解， 但可以在結(jié)腸內(nèi)被細(xì)菌酵解[13]。 膳食纖維又可分為可溶性和不可溶性兩類。 不可溶性膳食纖維作為植物細(xì)胞壁的纖維成分，在腸道內(nèi)可吸收水分、有害菌群和毒素，還可以增加腸道的蠕動(dòng)[14]。 可溶性膳食纖維在進(jìn)入結(jié)腸后能被盲腸和結(jié)腸內(nèi)的厭氧菌分解成為短鏈脂肪酸，能直接供給結(jié)腸黏膜細(xì)胞75%以上的能量[15]。 本研究中加復(fù)合膳食纖維的C、D 組較未加復(fù)合膳食纖維的A、B 組腸黏膜損傷明顯有所改善，血漿D-乳酸和內(nèi)毒素的表達(dá)呈顯著下降趨勢。 結(jié)果顯示，復(fù)合膳食纖維對(duì)門靜脈高壓大鼠的腸黏膜屏障功能有保護(hù)作用。

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