兔定位性動脈粥樣硬化發(fā)病機制的實驗研究

吳志勇 顏光烈 陳詩泉 浦曉東

福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院 福建省立醫(yī)院心內(nèi)科，福建福州 350001

動脈粥樣硬化的形成機制極其復雜，涉及血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞/單核細胞表型改變、血小板功能變化，進而相互影響，最終導致動脈粥樣硬化的形成。本文采用血管內(nèi)皮損傷及高脂飲食建立動脈粥樣硬化模型，觀察血管活性物質(zhì)及血小板功能變化，探討動脈粥樣硬化的形成機制及其內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

純種新西蘭大白兔48 只購自福建省藥檢所，雌雄不限，體重2.5～3.5 kg，5～6 月齡，每只單籠飼養(yǎng)于福建省立醫(yī)院動物實驗室內(nèi)。 隨機分為兩組：對照組6 只，喂養(yǎng)普通顆粒飼料（購自福建省科洪技術(shù)有限公司），每日100 g；模型組42 只，喂養(yǎng)高脂飼料（含1%膽固醇，6%豬油，93%普通飼料），每日100 g,自由飲水。

1.2 雙側(cè)髂動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)

模型組動物在相應飼料飼養(yǎng)7～10 d 后，行雙側(cè)髂動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg 經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，經(jīng)股動脈逆行插入球囊導管（導管直徑1.2 mm，球囊直徑2.5 mm，球囊長度20 mm，Cordis 公司產(chǎn)品），插入深度為6 cm，采用壓力注射器向球囊內(nèi)注入肝素生理鹽水，維持壓力4 atm，緩慢回拉導管至切口處，抽空球囊內(nèi)液體，重復上述過程3 次，退出導管，結(jié)扎動脈，縫合皮膚。以同樣方法剝脫對側(cè)髂動脈內(nèi)皮。 術(shù)后給予肌注青霉素80 萬U/只，連續(xù)3 d。對照組僅分離出相應動脈未予結(jié)扎及剝脫。繼續(xù)上述各自飼料喂養(yǎng)。

1.3 雙側(cè)髂動脈造影術(shù)

在高脂飼料喂養(yǎng)8 周后行髂動脈造影術(shù)。動物麻醉后，在1000 mA 血管數(shù)字減影機X 線透視下，經(jīng)右頸總動脈上段引入4F 造影導管（Cordis 公司產(chǎn)品）至腹降主動脈分叉上方，經(jīng)導管注入肝素300 單位后，快速注入38%泛影葡胺2～3 mL，并電影攝片。

1.4 觀察指標

在動物實驗室所有動物先進食普通飼料后1 周，稱體重，空腹自耳中央動脈抽血后，給予相應飼料喂養(yǎng)，并在內(nèi)膜剝脫術(shù)后7 周，復查血清或血漿指標。

1.4.1 血脂測定 空腹取血約2 mL 于10 mL 離心管中，1500 r/min 離心20 min（離心半徑8 cm），取上清液，采用美國貝克曼公司生產(chǎn)的SRX 型全自動生化分析儀測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.4.2 血清及血漿各指標測定 一氧化氮（NO）按試劑盒要求進行測定，購自南京建成生物工程有限公司（其濃度用μmol/L 為單位）；血漿內(nèi)皮素（ET）、血漿血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）分別采用125I-ET、125I-TXB2及125I-6-Keto-PGF1α標記的放射免疫分析法測定，按試劑盒要求進行，以GC-1200γ放射免疫計數(shù)器（中佳光電儀器分公司）記錄結(jié)果（其濃度以ng/L 為單位），試劑盒均購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。

1.4.3 血小板最大聚集率（MPA）測定 按試劑盒要求進行，以ADP（4 μmol/L）為誘導劑，運用北京普利生血液凝集儀LBY-NJ2 進行測定， 以百分率為單位；采用Medonic CA620 血常規(guī)分析儀自動測量血小板計數(shù)。

1.4.4 髂動脈狹窄情況測定 運用血管數(shù)字減影機放映攝片電影，測量雙側(cè)髂動脈的狹窄部位及其程度。

1.4.5 組織病理學檢查 在髂動脈造影術(shù)后，隨機取模型組動物6 只以及對照組動物，以生理鹽水、4%多聚甲醛溶液灌注髂動脈，分離雙側(cè)髂動脈，以造影片為參照，切取相應狹窄部位血管，置10%中性福爾馬林中繼續(xù)固定24 h。 根據(jù)造影片選取髂動脈血管0.5～1.0 cm，石蠟包埋，間斷均勻切片5～10 張，切片厚度5 μm，分別制作蘇木精伊紅染色，彈力纖維染色（醛品紅法）觀察形態(tài)學變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用配對或非配對t 檢驗，并進行多元線性回歸分析。 相關(guān)分析采用Pearson 分析。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂測定結(jié)果

實驗前（0 周）兩組間血脂水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），8 周后模型組TG、TC 及LDL-C 明顯高于對照組（P < 0.01），HDL-C 則明顯低于對照組（P <0.01）。 見表1。

表1 高脂飼料對兔血脂的影響（mmol/L，±s）

表1 高脂飼料對兔血脂的影響（mmol/L，±s）

注：與對照組同時間比較，*P ＜0.01；與同組0 周比較，△P ＜0.01；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

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2.2 血TXB2、6-Keto-PGF1α 及其比值的變化

實驗前（0 周）兩組間血TXB2、6-Keto-PGF1α及其比值差異無統(tǒng)計學意義 （P > 0.05），8 周后與對照組比較，模型組TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α明顯升高（P ＜0.01），而6-Keto-PGF1α明顯降低（P ＜0.01）。 見表2。

表2 血漿血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α 及其比值的變化（±s）

表2 血漿血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α 及其比值的變化（±s）

注：與對照組同時間比較，*P ＜0.01；與同組0 周比較，△P ＜0.01；TXB2：血栓素B2；6-Keto-PGF1α：6-酮-前列腺素F1α

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2.3 血NO、ET 及其比值的變化

實驗前（0 周）兩組間血NO、ET 及其比值差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），8 周后與對照組比較，模型組NO 及NO/ET 比值明顯降低（P ＜0.01），而ET 則明顯升高（P ＜0.01）。 見表3。

表3 血一氧化氮、內(nèi)皮素及其比值的變化（±s）

表3 血一氧化氮、內(nèi)皮素及其比值的變化（±s）

注： 與對照組同時間比較，*P ＜0.01；與同組0 周比較，△P ＜0.01；NO：一氧化氮；ET：內(nèi)皮素

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2.4 MPA、血小板計數(shù)（PLT）及體重（WT）變化

實驗前（0 周）兩組MPA、PLT 及WT 差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），8 周后與對照組比較，模型組MPA明顯升高 （P < 0.01），WT 及PLT 差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；8 周后對照組WT 較實驗前（0 周）有所增加（P ＜0.05）。 見表4。

表4 最大血小板聚集率、血小板計數(shù)及體重變化（±s）

表4 最大血小板聚集率、血小板計數(shù)及體重變化（±s）

注：與對照組同時間比較，*P ＜0.01；與同組0 周比較，#P ＜0.05，△P＜0.01；MPA：最大血小板聚集率；PLT：血小板計數(shù)；WT：體重

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2.5 動脈造影結(jié)果

對照組兔雙側(cè)髂動脈管壁光滑，管腔未見明顯狹窄或閉塞。模型組可見雙側(cè)髂動脈管腔不同程度的狹窄，甚至完全閉塞，自15%～100%不等，平均狹窄程度為（61.47±28.10）%，多為向心性狹窄，病變可呈局限性或彌漫性狹窄改變，多分布于30%～50%以及75%～100%之間。

2.6 血管狹窄程度與血漿或血清各指標的相關(guān)性分析

以每只兔的雙側(cè)髂動脈最大狹窄程度作為其狹窄程度，發(fā)現(xiàn)其狹窄程度與高脂飲食后血漿或血清NO濃度（r = -0.598，P < 0.01）、6-keto-PGF1α（r = -0.546，P < 0.01）、NO/ET 比值（r = -0.745，P < 0.01）、HDL-C濃度（r = -0.286，P < 0.05）呈負相關(guān)，而與血清或血漿ET（r = 0.477，P < 0.01）、TXB2（r = 0.881，P < 0.01）、MPA（r = 0.606，P < 0.01）、 TXB2/6-Keto-PGF1α比值（r = 0.672，P < 0.01）、TC（r = 0.466，P < 0.01）、LDL-C（r = 0.732，P < 0.01）呈正相關(guān)。 經(jīng)多元線性回歸分析顯示，其狹窄程度與TXB2及MPA 相關(guān)，Y=-75.478+0.583TXB2+0.874MPA，（R2= 0.804，P = 0.015）。

2.7 病理學改變

光鏡觀察：對照組兔髂動脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細胞連接緊密，其下可見完整的波浪狀內(nèi)彈力膜，中膜由多層整齊排列的平滑肌細胞組成， 細胞核多呈梭形，外彈力膜完整。 模型組髂動脈管壁明顯增厚，管腔向心或偏心性縮小；可見較稀疏的再生內(nèi)皮細胞形狀大小不一，核偏大；內(nèi)膜增厚，可見大量的脂質(zhì)和泡沫細胞、 膠原纖維以及核形狀不一排列紊亂的平滑肌細胞，部分嚴重者可見典型的粥樣斑塊，其表層為纖維結(jié)締組織，深部為無細胞的不定形物質(zhì)，其中含有膽固醇結(jié)晶、壞死組織和少量纖維素。 內(nèi)彈力膜呈不同程度斷裂，外彈力膜尚完整。

3 討論

本實驗顯示經(jīng)高脂飲食后，可見血中TG、TC 及LDL-C 均明顯增高，而HDL-C 明顯降低，與文獻報道[1]相似，有利于大量脂質(zhì)（膽固醇酯等）在血管壁內(nèi)沉積，誘發(fā)單核-巨噬細胞、平滑肌細胞等向內(nèi)膜遷移、浸潤，吞噬氧化LDL（OXLDL），最終形成泡沫細胞，并釋放各種細胞因子和生長因子，致使細胞外基質(zhì)合成增加，導致血管壁纖維化等病變。同時，也發(fā)現(xiàn)其變化程度與髂動脈的最大狹窄程度存在明顯相關(guān)性，與文獻報道相似[2]。

本實驗模型在高膽固醇飲食的同時，進行內(nèi)膜剝脫，嚴重地導致局部內(nèi)皮細胞的損傷、脫落、丟失，從而暴露內(nèi)皮下血管壁組織，可有利于脂質(zhì)侵入血管壁，同時也協(xié)同促進細胞外基質(zhì)的合成，有利于局部粥樣硬化的形成[3]。 大量動物實驗及臨床研究均已表明，高脂血癥可導致不同程度的內(nèi)皮功能異常，表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性舒張功能不全，血NO 濃度降低，ET 水平升高，以致血NO/ET 比值下降等[4-6]。 這與本模型所致的外周血改變相似。 高脂血癥時，可導致血管壁內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-）增高而導致NO 的滅活增加[7]；OXLDL 的升高，可明顯地抑制內(nèi)皮細胞中一氧化氮合酶（NOS）活性及其基因的表達，從而減少內(nèi)皮源性NO 的產(chǎn)生[4]；而OXLDL 還可刺激巨噬細胞及內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放ET-1[8]，導致血漿中ET 升高[5]，高膽固醇血癥除可導致ET-1 本身mRNA 表達增加[8]外，還可增加血管壁組織中內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶活性，進而引起組織內(nèi)ET 濃度的升高[5]，而且本模型顯示血漿中ET 水平與髂動脈的最大狹窄程度呈正相關(guān)，與文獻報道相似[6]。 在此模型中還發(fā)現(xiàn)血漿NO/ET 比值與病變程度呈負相關(guān)，NO、ET 的失衡，則可導致單核細胞的黏附、浸潤，促進了平滑肌細胞有絲分裂和增殖等，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。

高膽固醇血癥對內(nèi)皮功能的影響，不僅表現(xiàn)在NO、ET 之間的失衡，還導致血漿中前列環(huán)素（PGI2）的減少[9]。 PGI2和血栓素（TXA2）都是花生四烯酸在磷脂酶、環(huán)氧化酶催化下輾轉(zhuǎn)生成的產(chǎn)物，前者主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細胞，而后者主要產(chǎn)生于血小板，它們在血液中不穩(wěn)定，不易直接測定，檢測其代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1α和TXB2水平能較好地反映機體內(nèi)PGI2和TXA2水平。 本模型顯示在高膽固醇血癥兔血漿中PGI2下降，TXA2明顯升高，與文獻報道相似[9]，且其濃度變化與動脈粥樣硬化的主動脈壁內(nèi)改變相一致[9]，可見動脈粥樣硬化的形成與血漿中PGI2/TXA2平衡紊亂密切相關(guān)。 本模型中發(fā)現(xiàn)血漿TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α比值與髂動脈的最大狹窄程度呈正相關(guān)，而6-Keto-PGF1α與后者呈負相關(guān)，與Kobayashi 等[10]報道不相符，可能與動脈種類、選擇的模型動脈以及模型中內(nèi)皮是否剝脫不同有關(guān)。 OXLDL 可抑制內(nèi)皮細胞和血小板合成PGI2，促進TXA2的生成[11]。 PGI2和TXA2濃度改變及比例的失衡，有利于血管收縮、血小板聚集，參與動脈粥樣硬化的形成。

本模型顯示經(jīng)高膽固醇飲食后，兔ADP 誘導的MPA 明顯升高，與文獻報道相似，但對其動脈粥樣病變形成起作用較小[12]，與本模型不相符，可能與內(nèi)皮剝脫差異有關(guān)。高膽固醇血癥時可能血小板和血漿中花生四烯酸含量明顯增高[13-14]，而表現(xiàn)出血小板高反應性（血小板聚集率明顯升高、TXA2合成增加等）。 此外，本模型并未發(fā)現(xiàn)其血小板計數(shù)的變化，與文獻報道相似[15]。

經(jīng)多元回歸分析后顯示，動脈狹窄程度主要與血漿TXB2濃度及ADP 誘導的MPA 相關(guān)，在一定程度上體現(xiàn)了血小板分泌、聚集功能的變化在此模型中起著不可忽視作用，也反映了動脈粥樣硬化模型形成中，脂質(zhì)浸潤學說、內(nèi)皮細胞損傷學說及血栓學說間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。

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