一株產(chǎn)L-木酮糖菌株的分離篩選及鑒定

張玉寶，趙祥穎，楊麗萍，韓延雷，劉建軍1,,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省獸藥添加劑工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250306；3.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

一株產(chǎn)L-木酮糖菌株的分離篩選及鑒定

張玉寶1,2，趙祥穎3，楊麗萍3，韓延雷3，劉建軍1,3,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省獸藥添加劑工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250306；3.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

通過初篩和復(fù)篩從土壤中分離獲得1株能夠轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)一種稀有糖——L-木酮糖的芽孢桿菌ZN-14。利用該菌株的靜息細(xì)胞以20 g/L木糖醇為底物，在pH 9.0、37℃條件下轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到26.62%。通過對(duì)菌株ZN-14形態(tài)特征觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA基因序列同源性的分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

L-木酮糖；巨大芽孢桿菌；生物轉(zhuǎn)化

L-木酮糖（L-xylulose）是存在于多種生物體代謝途徑的戊酮糖[1]，其在自然界中濃度很低，是一種稀有糖?？诜﨤-木酮糖可以抑制腸道蔗糖酶和麥芽糖酶活性，能有效地抑制餐后血糖升高，是降血糖食品的理想活性成分[2]。此外，L-木酮糖可以作為其他稀有糖生產(chǎn)的前體物質(zhì)。例如，L-木酮糖可以通過L-鼠李糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木糖和L-來蘇糖[3]。顯然，為了更好地研究L-木酮糖在食品工業(yè)的應(yīng)用，重要的第一步是批量生產(chǎn)L-木酮糖用于進(jìn)一步研究。

國(guó)內(nèi)目前還未見L-木酮糖的研究報(bào)道，國(guó)外主要以多元糖醇為原料，通過化學(xué)和生物法轉(zhuǎn)化而成。化學(xué)法以D-山梨糖醇為原料合成L-木酮糖[4]，但存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多及純化繁瑣等缺點(diǎn)。生物法轉(zhuǎn)化L-木酮糖主要集中在利用菌體靜息細(xì)胞氧化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖。迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)噬夏孢歐文氏菌（后改名為菠蘿泛菌（Pantoea ananatis））[5]、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）[6]、蒼白芽孢桿菌（Bacillus pallidus）[7]3種細(xì)菌具有生物轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖的能力。在上述3種細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新型木糖醇-4-脫氫酶又稱為L(zhǎng)-木酮糖還原酶（EC 1.1.1.10），專一作用于D-蘇結(jié)構(gòu)[8]，轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖而后經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化進(jìn)入糖酵解途徑[9]。本實(shí)驗(yàn)從樹林采集土壤樣品，分離篩選到一株具有氧化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖的菌株并對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，旨在為進(jìn)一步研究生物轉(zhuǎn)化法制備L-木酮糖提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

參照土樣采集標(biāo)準(zhǔn)方法[8]采集土樣，26個(gè)土壤樣品分別采自濟(jì)南、泰安、淄博、威海、大同等地，采集時(shí)間均為2011年9月15日—10月10日。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、（NH4）2SO42.6、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

平板分離培養(yǎng)基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、（NH4）2SO42.6、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.1、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木糖醇30、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.4、CaCl2·2H2O 0.03、MnSO4·H2O 0.04、FeSO4·7H2O 0.03，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

木糖醇 山東福田藥業(yè)有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、咔唑（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；木酮糖（純度95%） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)天地試劑公司。

UltiMate3000型高效液相色譜儀 美國(guó)戴安公司；XW-80A 漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；BH-2 Olympus顯微鏡 日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；Anke TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離與篩選

1.4.1.1 平板分離

取1 g土樣于30 mL富集培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到新鮮富集培養(yǎng)基中，如此重復(fù)5次。富集樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-4、10-6、10-8、10-10這4個(gè)稀釋濃度的菌液1 mL分別涂布分離培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板，37℃培養(yǎng) 2 d。從平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接斜面保藏并進(jìn)行菌種初篩。

1.4.1.2 菌種初篩

將分離得到的菌株斜面接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。取培養(yǎng)液離心洗滌得到靜息細(xì)胞，加入10 mL質(zhì)量濃度為20 g/L木糖醇溶液（稱取20 g木糖醇溶于1 L、pH 9.0的Tris-HCl緩沖液，下同）轉(zhuǎn)化24 h，離心10 min，上清液半胱氨酸咔唑法顯色[9]，以目測(cè)法選出呈藍(lán)紫色者，作為產(chǎn)L-木酮糖菌株，留作復(fù)篩用。

1.4.1.3 菌種復(fù)篩

將初篩所得菌株斜面取1環(huán)接種于30 mL種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。然后吸取1 mL種子液接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每菌株平行3瓶。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中L-木酮糖含量，色譜柱：HYPERSIL C18柱（300 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-乙腈（體積比為20∶80）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器（RID，ShodexRI-100）；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：25 μL。使用圓盤旋光儀進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)化液的旋光性。

1.4.2 酶活力和轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

取10 mL培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液，于4℃、8 000 r/min離心10 min，得到菌體用Tris-HCl緩沖液（pH 9.0，50 mmol/L）洗滌2次，棄去上清即得到靜息細(xì)胞，加入10 mL木糖醇溶液，37℃、180 r/min反應(yīng)1 h。然后于100℃沸水浴加熱2 min終止酶反應(yīng)，待其冷卻后，離心10 min，取上清液，半胱氨酸咔唑法測(cè)定生成的L-木酮糖含量。

酶活力單位定義：在上述條件下，每毫升發(fā)酵液每分鐘產(chǎn)生1 μg L-木酮糖的酶量為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

式中：m為L(zhǎng)-木酮糖質(zhì)量/μg；V為發(fā)酵液體積/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

轉(zhuǎn)化率計(jì)算：在上述條件下，以生成的L-木酮糖與底物木糖醇的質(zhì)量之比表示。

1.4.3 生物量的測(cè)定

按細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法[8]，以660 nm波長(zhǎng)處的光密度值表示。

1.4.4 菌種鑒定

1.4.4.1 形態(tài)特征觀察

將目的菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂布，37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄其菌落特征；同時(shí)挑取平板上單菌落（37℃，24 h）進(jìn)行革蘭氏染色，10×100倍油鏡觀察并記錄觀察菌體形態(tài)。

1.4.4.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、V.P.實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、M.R.實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、糖醇類發(fā)酵，分別參照文獻(xiàn)[11-12]方法進(jìn)行。

1.4.4.3 16S rDNA的克隆及序列測(cè)定

將菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，收集菌體。按照UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作。擴(kuò)增引物序列：正向引物為5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，反向引物為5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取DNA模板1 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，反應(yīng)體系加超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)35，72℃延伸8 min。UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)片斷。由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中用BLAST在線同源性查詢軟件與GenBank中已登錄的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA 5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離純化

木糖醇是一種多數(shù)微生物不能利用的稀有糖醇，因此選擇木糖醇作為唯一碳源和能源，有利于直接分離篩選出具有多元糖醇氧化能力的菌株。樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后稀釋涂布平板，共分離得到菌種287株，初步確定這些菌株具有以木糖醇為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的能力，轉(zhuǎn)入斜面保藏以進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2.2 產(chǎn)L-木酮糖菌株的初篩

表1 土樣分離菌株的轉(zhuǎn)化能力Table 1 The biotransformation capacity of stains isolated from soil

采用搖瓶培養(yǎng)方法對(duì)分離得到的287株菌株進(jìn)行產(chǎn)酮糖能力初篩，結(jié)果如表1，用半胱氨酸-咔唑法對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行顯色后，有16株菌株出現(xiàn)了的藍(lán)紫色變化，其中，藍(lán)紫色較深的菌株有4株，分別為ZK-3、ZK-4、ZN-14、ZP-8，表明可能出現(xiàn)較大量的L-木酮糖。將這4株作為復(fù)篩實(shí)驗(yàn)用菌株。

2.3 產(chǎn)L-木酮糖菌株的復(fù)篩

表2 產(chǎn) 2 L-木酮糖菌株發(fā)酵及轉(zhuǎn)化結(jié)果Table 2 Formentation and biotransformation capacities of selected strains

對(duì)初篩所得菌株進(jìn)行了搖瓶復(fù)篩，用HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中L-木酮糖含量。由表2可知，菌株ZN-14轉(zhuǎn)化液中L-木酮糖含量最高，達(dá)到5.32 mg/mL，轉(zhuǎn)化率為26.62%，酶活力為2.6 U/mL。10℃室溫檢測(cè)質(zhì)量濃度為1 g/L轉(zhuǎn)化液，旋光性為左旋，旋光度為28°。菌株ZN-14轉(zhuǎn)化液HPLC圖譜、木酮糖標(biāo)樣HPLC圖譜和木糖醇標(biāo)樣HPLC圖譜見圖1、2（ZK-3、ZK-4、ZP-8菌株轉(zhuǎn)化液HPLC結(jié)果在此略去）。

圖1 菌株ZN-14靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖的HPPLLCC圖譜Fig.1 HPLC profiles showing the production of L-xylulose by resting cells of ZN-14

圖2 2 L-木酮糖和木糖醇標(biāo)樣HPLC圖譜PLCFig.2 HPLC profiles of mixed standards of L-xylulose and xylitol

2.4 菌種鑒定

2.4.1 菌株ZN-14形態(tài)學(xué)特征

菌株ZN-14在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色，個(gè)體較大，圓形，表面濕潤(rùn)有光澤，不透明，無褶皺，邊緣整齊，如圖3所示。菌株ZN-14經(jīng)結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察菌體呈桿狀散布或成串分布，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，芽孢呈橢圓形，中生，孢囊不膨大，如圖4所示。

圖3 菌株ZN-14菌落培養(yǎng)特征Fig.3 Colonial characteristics of strain ZN-14

圖4 菌株ZN-14細(xì)胞形態(tài)圖（×11 000000）Fig.4 Morphological characteristics of strain ZN-14 (×1 000)

2.4.2 菌株ZN-14生理生化鑒定

表3 菌株ZN-14的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain ZN-14

對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，結(jié)果見表3。菌株ZN-14能發(fā)酵葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇，葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、V.P.測(cè)定為陰性，H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、M.R.實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、淀粉和明膠水解均為陽(yáng)性。對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步將菌株ZN-14歸入芽孢桿菌屬。

2.4.3 菌株16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步確定菌株ZN-14的分類學(xué)位置，PCR獲得菌株ZN-14的16S rDNA基因的部分片段，長(zhǎng)度為800 bp，測(cè)定其16S rDNA基因序列。將該序列與美國(guó)國(guó)家生物信息中心收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ZN-14與芽孢桿菌屬的16S rDNA序列自然聚類。選取14株同屬內(nèi)同源性高的不同菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖5所示，ZN-14與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）IAM13418聚成一分支，序列相似性高達(dá)99%，表明ZN-14與巨大芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。

圖5 菌株ZN-14及相關(guān)菌株16S rDNA基因序列分析聚類結(jié)果Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZN-14 based on 16S rDNA sequences

3 結(jié) 論

從土壤中分離細(xì)菌樣品，以木糖醇為唯一碳源和能源，經(jīng)過定向篩選，得到1株可氧化木糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖的菌株ZN-14。利用該菌株的靜息細(xì)胞以木糖醇溶液（20 g/L，pH9.0）為底物在37℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到26.62%，酶活力為2.6 U/mL。通過對(duì)該菌株形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA基因序列同源性的分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

生物法轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖的菌株已有報(bào)道，然而使用巨大芽孢桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖未見相關(guān)研究，為生物轉(zhuǎn)化法制備L-木酮糖提供了新材料。靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于稀有糖生產(chǎn)同化學(xué)法相比，成本低、方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高并且沒有副產(chǎn)物的干擾。通過對(duì)菌株發(fā)酵和反應(yīng)工藝條件的優(yōu)化以及菌種改良等措施，進(jìn)一步提高L-木酮糖的產(chǎn)量是我們今后工作的方向。

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Isolation and Identification of a Novel L-Xylulose-Producing Strain

ZHANG Yu-bao1,2, ZHAO Xiang-ying3, YANG Li-ping3, HAN Yan-lei3, LIU Jian-jun1,3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2. Shandong Veterinary Medicine Additive Engineering Technology Research Center, Jinan 250306, China; 3. Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province, Jinan 250013, China)

A bacterium numbered as ZN-14 with the ability for efficient oxidization of xylitol to L-xylulose, a rare ketopentose, was isolated and purified from soil samples, through primary isolation and secondary screening. We have employed this isolated strain for the production of L-xylulose from xylitol by a resting cell reaction at 37 ℃ and pH 9.0. After 24 h, L-xylulose was produced at a yield of 26.62% when 20 g/L xylitol was utilized as the precursor. The strain was identifi ed as Bacillus megaterium, based on the sequence analysis of 16S rDNA and the general morphological and biochemical characteristics.

L-xylulose; Bacillus megaterium; biotransformation

Q939.9

A

1002-6630(2014)01-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201401039

2012-12-18

張玉寶（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：zhangyubao0201@163.com

*通信作者：劉建軍（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物開發(fā)與利用。E-mail：liujj-2000@163.com