pH值及底物對副干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的影響

王立梅，騰 宇，陳文飛，張 輝，儲開陽

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 常熟 215500）

pH值及底物對副干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的影響

王立梅1,2，騰 宇1，陳文飛1，張 輝1，儲開陽1

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 常熟 215500）

在7.5 L發(fā)酵罐中研究pH值及流加苯丙酮酸和葡萄糖對副干酪乳桿菌W2分批發(fā)酵產(chǎn)苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）的影響。結(jié)果表明：發(fā)酵液初始pH值、底物葡萄糖和苯丙酮酸對菌體生長和產(chǎn)物產(chǎn)量都有影響。控制發(fā)酵液pH值為6.5，采用間歇流加苯丙酮酸及連續(xù)流加苯丙酮酸和葡萄糖，發(fā)酵36 h后PLA產(chǎn)量分別達(dá)到1.148 g/L和2.121 g/L，苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化率分別為62.19%和47.2%，與分批發(fā)酵相比分別提高41.72%和161.53%。

副干酪乳桿菌；苯乳酸；苯丙酮酸；底物流加

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）是一種廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品和蜂蜜中的有機(jī)酸[1]。研究證實PLA具有廣譜且高效的抗菌活力，可以有效抑制包括食源性致病細(xì)菌、酵母和霉菌等多種微生物的生長，并且可以替代抗生素用于家畜飼養(yǎng)[2-4]。PLA具有較寬pH值范圍、熱穩(wěn)定性高、溶解性好、易于在各種食品體系中擴(kuò)散、對人和動物細(xì)胞均無毒性等優(yōu)點(diǎn)，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供廣闊的前景[5-6]。

PLA生產(chǎn)包括化學(xué)合成法和發(fā)酵法。據(jù)報道[7-9]，能夠產(chǎn)生PLA的微生物包括霉菌、芽孢桿菌、丙酸菌和乳酸菌，其中多數(shù)乳酸菌都具備合成PLA能力。然而乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，會抑制細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物形成[10]。另外，PLA是乳酸菌代謝產(chǎn)物苯丙氨酸的分解代謝產(chǎn)物，而苯丙氨酸在細(xì)胞內(nèi)不會過量積累，因此限制了PLA的合成[11]。乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)PLA的關(guān)鍵是提高菌體濃度和PLA產(chǎn)量，因此維持發(fā)酵體系pH值穩(wěn)定，并通過外源添加中間產(chǎn)物苯基丙酮酸可以顯著提高PLA產(chǎn)量[12]。

本研究以1株產(chǎn)苯乳酸副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）W2為出發(fā)菌株[13]，采用7.5 L發(fā)酵罐對發(fā)酵體系中pH值和底物流加進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到提高PLA發(fā)酵水平的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌（L. paracasei）W2，本實驗室篩選（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CCTCC No. M209318）。

1.1.2 試劑

葡萄糖試劑盒 保定長城臨床試劑有限公司；苯乳酸及苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；苯丙酮酸 山東綠源天然原料有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨10、牛肉膏10、乙酸鈉5、K2HPO42、檸檬酸二銨2、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1mL/L，pH 6.5，121℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨15、乙酸鈉5、K2HPO42、檸檬酸二銨1.8、MgSO40.58、MnSO40.25、苯基丙酮酸3，吐溫-80 4 mL/L，pH 6.5～7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；BioFlo110發(fā)酵罐 美國NBS公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi Koki公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將活化后的菌種先接入種子培養(yǎng)基中，30℃靜止培養(yǎng)18 h，然后按體積分?jǐn)?shù)5%接種量再接入500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)后備用。

初始pH值對苯乳酸產(chǎn)量的影響：將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)整到4.5～8.5范圍內(nèi)，于30℃、接種量10%條件下，在7.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵36 h，測定PLA產(chǎn)量與生物量。

分批發(fā)酵：按照上述確定的最佳初始pH值，于接種量10%、30℃條件下，在7.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵36 h，每3 h測定苯乳酸產(chǎn)量、葡萄糖含量、pH值與生物量。

恒定pH值發(fā)酵：在7.5 L發(fā)酵罐中裝入3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%，采用10 mol/L的NaOH控制pH值為6.5，每小時間歇攪拌2 min，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，30℃發(fā)酵36 h。每3 h檢測葡萄糖含量、生物量和PLA產(chǎn)量。

補(bǔ)料發(fā)酵：補(bǔ)料發(fā)酵在7.5 L全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行，裝液量3 L，接種量10%，發(fā)酵溫度30℃，采用10 mol/L NaOH流加控制發(fā)酵液pH 6.5。補(bǔ)料從發(fā)酵6 h開始至發(fā)酵結(jié)束，間歇補(bǔ)料為每3 h流加苯丙酮酸（18 g/L）40 mL（總添加量為400 mL），最終發(fā)酵液體積3 900mL；連續(xù)補(bǔ)料苯丙酮酸質(zhì)量濃度50 g/L，流加速率13 mL/h；連續(xù)補(bǔ)料葡萄糖質(zhì)量濃度500 g/L，在發(fā)酵6～15 h葡萄糖流加量為8 mL/h，在15～36 h葡萄糖流加量為18 mL/h，最終發(fā)酵液體積4 340 mL。發(fā)酵罐攪拌速度為50 r/min。每3 h檢測葡萄糖含量、生物量和PLA產(chǎn)量。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 葡萄糖含量測定

采用葡萄糖氧化酶法，按照試劑盒說明書操作。

1.3.2.2 生物量測定

取50 mL發(fā)酵液離心后收集菌體，蒸餾水洗滌3次，于105℃干燥、稱質(zhì)量。

1.3.2.3 PLA提取與測定

將發(fā)酵液離心，取上清液調(diào)整pH 2.0，然后加入2倍體積的乙酸乙酯萃取，減壓蒸發(fā)濃縮，得到PLA樣品，經(jīng)0.22 μm纖維素膜過濾，取濾液進(jìn)行HPLC測定。

HPLC條件：色譜柱C18柱，流動相A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液，檢測波長210 nm，柱溫30℃，總流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

苯乳酸產(chǎn)率按下式計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH值對PLA產(chǎn)量的影響

如圖1所示，發(fā)酵液初始pH值對副干酪乳桿菌W2菌體生長和代謝影響較大，初始pH值為6.5～7.0時有利于菌體生長和PLA積累，初始pH值呈酸性或堿性均不利于乳酸菌生長和代謝產(chǎn)物積累。

2.2 分批發(fā)酵

圖2 PLA分批發(fā)酵曲線Fig.2 Time course of fed-batch fermentation

由圖2可知，發(fā)酵前期，生物量和PLA產(chǎn)量隨時間延長呈指數(shù)增長，而葡萄糖質(zhì)量濃度迅速下降，發(fā)酵9 h葡萄糖基本消耗盡，發(fā)酵液pH值降至4.1，菌體生長受到限制，生物量最高為3.014 g/L，PLA產(chǎn)量為0.811 g/L。

2.3 恒定pH值分批發(fā)酵

圖3 恒定pH值PLA分批發(fā)酵曲線Fig.3 Time course of fed-batch fermentation at a constant pH

pH值控制在6.5，考察恒定pH值對副干酪乳桿菌W2生長及其代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果如圖3所示。菌體的生長速率和PLA的合成量都得到提高，細(xì)胞濃度和PLA產(chǎn)量最高分別達(dá)到5.308 g/L和0.936 g/L，分別比未控制pH值時提高76.11%和15.56%，對數(shù)生長期從6 h延長到9 h。在發(fā)酵12 h，葡萄糖幾乎耗盡，細(xì)胞生長明顯受到抑制，產(chǎn)物合成受到限制。

2.4 恒定pH值間歇補(bǔ)料苯丙酮酸發(fā)酵

圖4 恒定pH值間歇補(bǔ)料苯丙酮酸發(fā)酵曲線Fig.4 Time course of PLA production with intermittent feeding of PPA at a constant pH

pH值控制在6.5，間歇流加苯丙酮酸對副干酪乳桿菌W2生長及其代謝產(chǎn)物的影響如圖4所示。發(fā)酵0～9 h，菌體生長迅速，隨后到達(dá)穩(wěn)定期；葡萄糖含量迅速下降，12 h幾乎耗盡，細(xì)胞的生長受到限制；發(fā)酵0～18 h時，PLA的產(chǎn)量呈指數(shù)增長，18 h后增長趨勢減緩。苯丙酮酸添加明顯提高了PLA產(chǎn)量，36 h達(dá)到1.148 g/L，PLA產(chǎn)率為62.19%。

2.5 恒定pH值連續(xù)補(bǔ)料葡萄糖和苯丙酮酸

如圖5所示，發(fā)酵0～24 h，連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵中菌體細(xì)胞一直處于連續(xù)增長狀態(tài)，30 h時，菌體生物量達(dá)到最高5.945 g/L；發(fā)酵0～9 h時PLA產(chǎn)量迅速增加，然后呈緩慢上升趨勢，發(fā)酵36 h，產(chǎn)量達(dá)到2.121 g/L，比分批發(fā)酵分別提高了97.25%和161.53%，PLA產(chǎn)率為47.2%。

圖5 恒定pH值連續(xù)補(bǔ)料葡萄糖和苯丙酮酸發(fā)酵曲線Fig.5 Time course of PLA production with continuous feeding of both PPA and glucose at constant pH

3 結(jié)論與討論

本研究考察了在7.5 L發(fā)酵罐中控制恒定pH值及流加底物葡萄糖和苯丙酮酸對副干酪乳桿菌W2分批發(fā)酵生產(chǎn)PLA的影響。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸使發(fā)酵液pH值降低，會導(dǎo)致細(xì)胞生長環(huán)境的酸化，造成了所謂的“酸脅迫”。乳酸菌在酸環(huán)境脅迫下，應(yīng)激產(chǎn)生一系列應(yīng)激蛋白（UspA蛋白），使菌體迅速適應(yīng)環(huán)境的變化[14]。有研究顯示，UspA蛋白是通過調(diào)節(jié)生物膜的形成、增加菌體的運(yùn)動和黏附性、保護(hù)和修復(fù)DNA系統(tǒng)等功能來應(yīng)對環(huán)境的脅迫以保護(hù)細(xì)胞，使菌體在逆境環(huán)境中存在[15-17]。酸脅迫嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理活性，引起細(xì)胞膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性發(fā)生變化，影響酶的活性，進(jìn)而影響乳酸菌的生長及代謝[18-20]。通過控制發(fā)酵液pH值，副干酪乳桿菌W2的菌體濃度明顯增加，同時連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵36 h，生物量和PLA產(chǎn)量較分批發(fā)酵分別提高了97.25%和161.53%。但連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵過程中PLA產(chǎn)率明顯下降。苯丙酮酸是PLA生產(chǎn)過程中間產(chǎn)物，當(dāng)苯丙酮酸濃度過高時，反應(yīng)向苯丙氨酸反應(yīng)方向進(jìn)行[21]。通過進(jìn)一步對發(fā)酵液的高效液相圖譜分析和對副干酪乳桿菌W2轉(zhuǎn)氨酶酶學(xué)性質(zhì)研究（尚未發(fā)表）都發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯丙酮酸濃度過高時，苯丙氨酸含量明顯增加，不利于PLA的合成。因此，恰當(dāng)?shù)谋奖崃骷臃椒▽⒂欣谔岣逷LA產(chǎn)量。

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Effects of pH and Substrate Feeding on Phenyllactic Acid Production by Lactobacillus paracasei W2

WANG Li-mei1,2, TENG Yu1, CHEN Wen-fei1, ZHANG Hui1, CHU Kai-yang1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. Suzhou Key Laboratory of Food Biotechnlogy, Changshu 215500, China)

In this paper, the effects of initial medium pH and feeding of the substrates glucose and phenylpyruvic acid (PPA) on the production of phenyllactic acid (PLA) by Lactobacillus paracasei W2 in a 7.5 L fermentor were studied. The results indicated that all three factors generated corresponding effects on cell growth and PLA production. Two substrate feeding strategies, intermittent feeding of PPA and continuous feeding of both glucose and PPA were performed and the initial medium pH was set to 6.5. After 36 h of fermentation under these conditions, PLA production reached 1.148 g/L and 2.121 g/L, respectively, and the conversion rate of PPA reached 62.19% and 47.2%, respectively. In addition, in comparison with fedbatch fermentation, the PLA yield was enhanced by 41.72% and 161.53%, respectively.

Lactobacillus paracasei; phenyllactic acid; phenylpyruvic acid; substrate feeding

TQ921.3

A

1002-6630(2014)01-0163-04

10.7506/spkx1002-6630-201401032

2013-07-27

國家農(nóng)業(yè)科研成果轉(zhuǎn)化資金項目（2013GB2C100176）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2011393）；蘇州科技支撐計劃項目（SN201130）；常熟市科技發(fā)展計劃項目（CN201220）

王立梅（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wlmqb@126.com