酶法預(yù)處理壓榨月見草油工藝優(yōu)化

王俊國，張 歡，劉 飛，劉丹怡，潘明喆,*，于殿宇

（1.吉林工商學(xué)院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林 長春 130062；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酶法預(yù)處理壓榨月見草油工藝優(yōu)化

王俊國1，張 歡2，劉 飛2，劉丹怡2，潘明喆2,*，于殿宇2

（1.吉林工商學(xué)院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林 長春 130062；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以月見草籽為原料，采用酶法預(yù)處理后再壓榨的方法制取月見草油，先用復(fù)合酶（復(fù)合多糖酶、植物水解酶、纖維素酶比為4∶1∶1）對月見草籽進(jìn)行前處理，通過單因素和正交試驗確定最佳酶解條件為酶解溫度50℃、酶解pH 5.0、酶用量2%、酶解時間5.5 h，在此條件下游離油得率24%，然后將含油物料烘干后調(diào)整水分至9%，以60℃為初始入榨溫度進(jìn)行壓榨，最后得出在壓榨溫度90℃、壓榨壓力3.5 MPa時，出油率可達(dá)69%。制取得到的月見草油中的γ-亞麻酸以及亞油酸等不飽和酸被很好的保留，油脂品質(zhì)良好。

月見草油；酶法；壓榨；出油效率；指標(biāo)測定

月見草（Oenothera biennis L.）俗名山芝麻，由于其花開多在夜間，且淡香清雅，又名夜來香[1-3]。月見草籽中含有20%～30%的月見草油[4]，月見草油中γ-亞麻酸含量為9%～12%和亞麻酸含量為73%～76%[5-6]，其種子經(jīng)過榨油、皂化、酸化可先獲得γ-亞麻酸，以此為原料，經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，再經(jīng)過生物合成即可得到前列腺素E1，它是抗血栓、擴血管新藥，廣泛用于血栓性脈管炎、心肌梗塞等。研究表明γ-亞麻酸降低膽固醇的效果是亞油酸的170倍，另外其還可消除氧自由基，延緩皮膚結(jié)構(gòu)組織衰老，使皮膚柔軟且彈性十足[7-9]。因此γ-亞麻酸被譽為“21世紀(jì)功能性食品的主角”[10]。但是人體不能合成γ-亞麻酸，只能通過飲食來攝取，而月見草油是天然的含γ-亞麻酸的最好資源[11]。20世紀(jì)80年代迄今，西歐北美等發(fā)達(dá)國家及中國的科研驗人員極其注重對月見草油的應(yīng)用研究以及相關(guān)產(chǎn)品的研制推廣，近年來我國科研人員在保健醫(yī)療、日常食用等方面對月見草油的作了大量的研究開發(fā)工作，并開發(fā)出了多種相關(guān)產(chǎn)品。目前對月見草油的提取多采用壓榨法以及溶劑浸出法，壓榨法是傳統(tǒng)的榨油方法，存在出油效率低，設(shè)備磨損嚴(yán)重，月見草油品質(zhì)較差，γ-亞麻酸富集率不高，副產(chǎn)品難于利用等問題。溶劑法提取月見草油，具有提油率高、成本低等優(yōu)點，但是在制取完成后溶劑易殘留，且后續(xù)需要脫溶處理，這易使部分γ-亞麻酸遭到破壞，而且容易生成反式脂肪酸[12]。近年來的研究表明，用酶處理可提高油脂得率。本研究采用酶法預(yù)處理后再壓榨的方法，即對月見草籽進(jìn)行充分的酶解前處理，在此過程中收集部分優(yōu)質(zhì)油脂，又能充分破壞月見草細(xì)胞壁，降低了進(jìn)一步壓榨的難度，同時也降低了壓榨溫度避免月見草油在高溫下變質(zhì)，很好地保護(hù)了月見草油中的γ-亞麻酸以及亞油酸等不飽和酸，所獲油脂品質(zhì)完美，為實現(xiàn)月見草油工業(yè)化制取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月見草籽（原料含油量16.1%、含水量8%） 吉林市圣基實業(yè)有限公司；復(fù)合多糖酶（100 FBG/g、最適pH 5、最適溫度40 ℃）、植物水解酶（100 FBG/mL、最適pH 4.6、最適溫度50 ℃）、纖維素酶（1.5×104U/g、最適pH 5、最適溫度40 ℃） 諾維信公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠；YJYII型榨油機 北京益加益食品機械研究所；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司；CP-Sil-88強極性毛細(xì)管氣相色譜柱 美國Varian公司；H-T7650透射電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 操作工藝流程

由于月見草籽在入榨之前破壁比較充分，油脂會存在于殼壁碎末里，所以為了提高壓榨出油率，本研究將初榨餅部分回榨，月見草籽回榨量可以根據(jù)生產(chǎn)情況以及原料質(zhì)量適當(dāng)調(diào)控。一般來講回榨量增大回榨次數(shù)增多，可提高月見草油出油率，但過度回榨會降低產(chǎn)品質(zhì)量；如果回榨量減少或次數(shù)減少，雖然可提高產(chǎn)品質(zhì)量，但會減少壓榨出油率，使出榨餅殘油率升高，粉末度增大，給后續(xù)的精制過程帶來不利影響。一般來講回榨量可控制在壓榨月見草籽餅總量的1/3左右，回榨次數(shù)2次。

1.3.2 復(fù)合酶添加操作過程[13]

復(fù)合多糖酶、植物水解酶、纖維素酶按4∶1∶1的比例加入油料，料液比1∶6。

1.3.3 游離油得率[14]與出油率的計算

1.3.4 指標(biāo)測定

酸價測定：參照GB/T 5530—2005《動植物油脂：酸值和酸度測定》；碘價測定：參照GB/T 5532—2008《動植物油脂：碘值的測定》；皂化值測定：參照GB/T 5534—2008《動植物油脂：皂化值的測定》。

1.3.5 氣相色譜測定方法

CP-Sil-88強極性毛細(xì)管氣相色譜柱（100m×0.20 mm，0.2μm）；檢測器：火焰離子化檢測器。載氣為N2，燃燒氣為H2和空氣；進(jìn)樣口溫度260℃，柱前壓200kPa；升溫程序：柱溫45 ℃保留4min，以13℃/min的速度升溫至175℃保留27 min，再以4℃/min的速度升溫至215℃保留40min；檢測溫度：260 ℃；H2壓力：60kPa；空氣壓力：50kPa；進(jìn)樣量：1.0?L，分流比：1∶80。

1.3.6 酶解后月見草籽的透射電鏡觀察

將酶解后的月見草籽切成約1 mm3的小塊，經(jīng)戊二醛固定、漂洗、丙酮脫水、浸透、環(huán)氧樹脂包埋、切片、醋酸枸緣酸電子染色等步驟制成超薄切片，使用透射電子顯微鏡觀察月見草籽細(xì)胞的內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對出油率的影響

月見草籽在pH 5.0、酶用量2%、反應(yīng)時間4.5 h、溫度分別為35、40、45、50、55 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后進(jìn)行萃取，稱取油的質(zhì)量，得到出油率，結(jié)果見圖1。

圖1 酶解溫度對出油率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on oil yield

由圖1可以看出，當(dāng)酶解溫度為50℃時，月見草籽的出油率最高；當(dāng)溫度低于50℃時，隨著溫度的不斷升高，出油率隨之升高；當(dāng)溫度高于50℃時，隨著溫度的升高，出油率呈現(xiàn)下降趨勢。這說明，酶反應(yīng)存在最適溫度，在最適反應(yīng)溫度時，酶活力最大，出油效率達(dá)到最高，超過最適反應(yīng)溫度，酶部分失活，出油率降低。所以50℃時為最適的酶解溫度。

2.1.2 酶解pH值對出油率的影響

月見草籽在溫度50℃、反應(yīng)時間4.5 h、酶用量2%，酶解pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的條件下進(jìn)行酶解，然后進(jìn)行萃取，得到出油率，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解pH值對出油率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on oil yield

從圖2可以看出，隨著pH值的增加，月見草籽的出油率也在增加，當(dāng)pH 5.0時，出油率達(dá)到最高值，但是隨著pH值的繼續(xù)升高，月見草籽的出油率反而下降，這是由于在堿性條件下，酶的活性受到了抑制，導(dǎo)致酶活下降，使出油率降低，所以最適酶解pH 5.0。

2.1.3 酶用量對出油率的影響

月見草籽溫度50 ℃、反應(yīng)時間4.5 h、酶解pH 5.0、酶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%的條件下進(jìn)行酶解，然后進(jìn)行萃取，得到出油率，結(jié)果見圖3。

圖3 酶用量對出油率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on oil yield

從圖3可以看出，當(dāng)加酶量為2%時，出油率較高，隨著加酶量的增加，出油率也增加，這是由于在底物濃度一定的情況下，與底物作用的酶用量越大，酶解越徹底，從而使更多的油脂能夠釋放出來。酶加入量對酶解反應(yīng)非常重要，如果加酶量較少，則不能夠充分降解細(xì)胞，從而降低出油率；若加酶量太多，則增加了生產(chǎn)成本，綜合考慮，本試驗為降低成本酶用量選擇2%。

2.1.4 酶解時間對出油率的影響

月見草籽在溫度50 ℃、酶用量2%、酶解pH 5.0、反應(yīng)時間1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h的條件下進(jìn)行酶解，然后進(jìn)行萃取，得到出油率，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時間對出油率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on oil yield

從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，月見草籽初榨餅出油率升高。在最初的酶解階段，出油率提高得較為明顯，后來的作用效果就不太明顯，酶解時間長短是使油料細(xì)胞有較大程度降解的關(guān)鍵，因此適合的時間應(yīng)該根據(jù)出油率來確定。酶解時間長有利于出油，但酶解時間超過4.5 h后出油率增加緩慢，從工作效率、設(shè)備利用以及能耗等經(jīng)濟角度來衡量，最適的酶解時間為4.5 h。

分別吸取5 mL溶液于兩個無菌細(xì)口三角瓶中，分別加入無菌的MRS培養(yǎng)基和ATB培養(yǎng)基，然后再添加終濃度為10%vol的乙醇和終濃度為10 mg/LSO2的亞硫酸溶液。25℃厭氧培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液鏡檢并革蘭氏染色為陽性后，繼續(xù)上述條件轉(zhuǎn)接3次。

2.1.5 酶解過程的正交試驗

將月見草籽清理粉碎，過40目篩，用酶處理月見草籽，選取酶解溫度、pH值、酶用量、酶解時間為主要影響因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，確定最佳反應(yīng)條件，結(jié)果見表1。

表1 酶法預(yù)處理正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 The orthogonal array design and correspoding resutls

由表1可以看出，pH值對制油工藝的影響最大，其次是溫度、酶用量、酶解時間。最適宜的萃取條件是A2B2C2D3，酶解過程的最佳條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、酶用量2%、酶解時間5.5h。在最佳條件下，用酶處理月見草籽后離心得到游離油和含油物料，游離油得率24%。

2.1.6 月見草游離油精煉后各項指標(biāo)的測定

對酶處理所得月見草油進(jìn)行檢測，由表2可知，由于酶解溫度溫和且不加入任何溶劑，所以此處所得月見草油幾乎完全保留了月見草籽中的營養(yǎng)成分。

表2 月見草游離油中各項指標(biāo)的測定Table2 Chemical analysis and fatty acid composition of free oil of evening primrose

2.1.7 酶解月見草籽的透射電鏡觀察

圖5 月見草籽的透射電鏡照片F(xiàn)ig.5 TEM images of control and pretreated evening primrose seeds

由圖5可見，空白樣品的超薄切片照片可清楚的看到月見草籽內(nèi)部結(jié)構(gòu)，月見草籽細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部充滿了內(nèi)容物，沒有發(fā)生外溢；用纖維素酶處理后，細(xì)胞壁不再連續(xù)完整，有油脂等內(nèi)容物外溢；用復(fù)合酶處理后的月見草籽細(xì)胞壁被充分破壞，內(nèi)部的油脂等內(nèi)容物外溢。因此，可以認(rèn)為用復(fù)合酶處理能夠完全破壞月見草籽壁，并釋放出油脂。

2.2 離心剩余含油物料壓榨試驗

2.2.1 壓榨物料水分含量的確定

油料入榨水分可以通過蒸炒烘干加以人為控制，如果入榨含油物料水分含量過低，油料粒子之間由于結(jié)合不緊密很難成型或成型困難，物料不能成型會造成排油壓力過小，物料間可塑性偏低，不能封閉油料的外表面以及內(nèi)表面孔道，密度增加不明顯[15]；這樣會造成油滴以非連續(xù)相聚集形成，產(chǎn)生不了排油高壓或排油高壓過小，達(dá)不到深度出油的效果。如果水分過少且溫度低，油料容易扭結(jié)成團封閉內(nèi)外表面孔道，造成出油堵塞。所以根據(jù)油料本身以及壓榨需求可以逐漸增加水分，這樣會使油料可塑性增加，改善出油效果。通常含水率的增減應(yīng)遵循“高溫低水分，低溫高水分”的規(guī)律，其具體數(shù)值可以根據(jù)N.B.葛符里林柯的經(jīng)驗公式進(jìn)行計算[16]：

式中：C為油料含水率/%；T為油料壓榨溫度/℃；K為入榨料含油率校正系數(shù)，K=（100－M）/55，M為入榨料含油率/%。按照GB/T 14488.1—93《油料種籽含油量測定方法》對壓榨對象（酶解后月見草籽膨化料）進(jìn)行含油率的測定，得其含油率為13.01%，取壓榨溫度為60 ℃。通過式（3）則可以得出月見草籽膨化料的最佳出油時含水率約為9%，水分含量主要在入榨前進(jìn)行調(diào)節(jié)，為此增加了烘干工藝，烘干溫度60 ℃、時間90 min。

2.2.2 入榨溫度對月見草油出油率的影響

對酶解烘干膨化后的月見草籽含油物料進(jìn)行壓榨，考察在壓榨溫度80 ℃、壓榨壓力3.5 MPa、入榨溫度40、50、60、70、80 ℃的條件下，考察入榨溫度對出油率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 入榨溫度對月見草籽出油率的影響Fig.6 Effect of initial pressing temperature on oil yield

經(jīng)酶解膨化處理后的物料，如果入榨溫度過低月見草籽物料彈性及塑性較差，在壓榨時難以形成高壓出油壓力，不利于提高月見草籽出油率，但如果入榨溫度過高，會嚴(yán)重影響出油品質(zhì)，加深油脂色澤，而且溫度過高，油料中磷脂等雜質(zhì)也會增加[17]，根據(jù)圖6可知，40～60 ℃范圍內(nèi)隨著入榨溫度升高，出油率明顯升高，在60 ℃后出油率提高不明顯，綜合上述理由選擇入榨溫度為60 ℃。

2.2.3 壓榨溫度對月見草油出油率的影響

對酶解烘干膨化后的月見草籽含油物料進(jìn)行壓榨，考察在入榨溫度60 ℃、壓榨壓力3.5 MPa、壓榨溫度為60、70、80、90、100℃的條件下，考察壓榨溫度對出油率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 壓榨溫度對出油率的影響Fig.7 Effect of pressing temperature on oil yield

在壓榨過程中壓榨溫度的變化會直接影響到壓榨出油率以及出油品質(zhì)，隨著溫度的升高油脂黏度系數(shù)變小，油脂流動性增強，這樣在壓榨過程中油脂更便于流出。酶解膨化后月見草籽壓榨溫度過高，將會使油料中亞油酸以及亞麻酸氧化，特別是γ-亞麻酸，且會使油料中反式脂肪酸增多[18-19]，降低月見草油作為保健油的質(zhì)量。由圖7可知，雖然隨著壓榨溫度的升高，出油率不斷升高，但在80 ℃以后出油率升高緩慢，綜合以上原因選擇壓榨溫度為80 ℃。

2.2.4 壓榨壓力對月見草油出油率的影響

對酶解烘干膨化后的月見草籽含油物料進(jìn)行壓榨，考察在入榨溫度60 ℃、壓榨溫度80 ℃、壓榨壓力為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 MPa的條件下，考察壓榨壓力對油率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 壓榨壓力對出油率的影響Fig.8 Effect of pressing pressure on oil yield

油料在榨鏜內(nèi)的壓榨過程是一個不斷運動變形的過程。“動態(tài)瞬時高壓”可以將油脂從油料細(xì)胞中快速擠壓流出，但這種瞬時高壓由于時間較短擠出油脂沒有時間聚集流出，造成油路閉塞阻礙壓榨油脂的順利流出[20]。因此，必須選擇合理的壓力以及平衡榨鏜壓力，由圖8可知，在壓榨壓力為3.0～3.5 MPa時出油率急劇上升，在3.5 MPa后壓力上升不明顯且有下降趨勢。當(dāng)壓力超過3.5 MPa后，月見草籽餅粉與擠壓出油脂混溶在一起，難以分離。所以綜合以上因素選擇壓榨壓力為3.5 MPa。

2.2.5 壓榨過程的正交試驗

表3 離心剩余含油物料壓榨正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 The orthogonal array design and corresponding results for optimization of oil pressing from the pretreated evening primrose seeds

將用酶處理月見草籽后離心得到含油物料放入壓榨機中，選取入榨溫度、壓榨溫度、壓榨壓力為主要影響因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，確定最佳反應(yīng)條件，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，壓榨壓力對制油工藝的影響最大，其次是壓榨溫度、入榨溫度。最適宜的壓榨條件是A2B3C2，最后得出壓榨過程的最佳條件為入榨溫度60℃、壓榨溫度90℃、壓榨壓力3.5 MPa。在最佳條件下，出油率為69%。

2.2.6 酶解后壓榨月見草油各項指標(biāo)測定

表4 酶法處理后壓榨月見草油各項指標(biāo)的測定Table4 Chemical analysis and fatty acid composition of the oil pressed from the the pretreated evening primrose seeds

由表4可以看出，月見草油中各成分保留較完好，因為前期酶解和膨化對月見草籽細(xì)胞壁破壞較完全，所以后期壓榨處理條件溫和，較好地保留了月見草中的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是γ-亞麻酸。

3 結(jié) 論

本實驗以2%的復(fù)合酶對月見草籽進(jìn)行前處理，離心得到游離油和含油物料，游離油得率24%，然后烘干物料調(diào)整水分至9%進(jìn)行擠壓膨化，以60 ℃的溫度為初始入榨溫度進(jìn)行壓榨，壓榨溫度90 ℃，在壓榨壓力3.5 MPa時月見草出油率最高可達(dá)到69%。傳統(tǒng)的壓榨法出油率為50%～60%，出油率比酶解預(yù)處理再壓榨的方法的低，而且月見草油品質(zhì)較差、γ-亞麻酸富集率不高；雖然溶劑浸提法的出油率可達(dá)98%以上，但是在制取完成后溶劑易殘留，且后續(xù)需要脫溶處理，這易使部分γ-亞麻酸遭到破壞，而且容易生成反式脂肪酸；酶法預(yù)處理后再壓榨的方法制取的月見草油，不僅解決了壓榨法出油率低的問題，而且得到的月見草油中γ-亞麻酸被很好地保留，油脂品質(zhì)良好。

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Optimization of Enzymatic Pretreatment Process for Pressing of Evening Primrose Oil

WANG Jun-guo1, ZHANG Huan2, LIU Fei2, LIU Dan-yi2, PAN Ming-zhe2,*, YU Dian-yu2
(1. Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province, Jilin Business and Technology College, Changchun 130062, China; 2. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In this work, evening primrose oil was pressed from enzymatically pretreated samples of evening primrose seeds. The enzymatic pretreatment was carried out using a mixture composed of a commercial complex enzyme preparation hydrolyzing carbohydrates, viscozyme and cellulase (all from Novozymes, 4:1:1). By using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods, the optimal enzymatic pretreatment conditions were determined to be hydrolysis for 5.5 h at 50 ℃, initial pH 5.0 with a total enzyme dosage of 2%. Under these conditions, the yield of free oil was 24%. The pretreated material was dried until the moisture content reached 9%, and then pressed initially at 60 ℃, finally at 90 ℃ and 3.5 MPa, resulting in an oil yield of 69%. γ-Linolenic, linoleic and some other unsaturated fatty acids were retained at significant levels in the evening primrose oil, and the oil quality was good.

evening primrose oil; enzymatic method; pressing; oil yield; determination of quality parameters

TQ645

A

1002-6630（2014）02-0096-06

10.7506/spkx1002-6630-201402018

2013-08-31

糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室基金項目（2013006）；黑龍江省科技計劃項目（GC13B207）

王俊國（1964—），男，教授，學(xué)士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：junguowang5283@163.com

*通信作者：潘明喆（1979—），男，講師，碩士，研究方向為大豆精深加工技術(shù)。E-mail：dyyu2000@126.com