銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)小鼠急性毒性和細(xì)胞毒性研究

李焰，林香燕，張繼欣，尹會(huì)方

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364000；2.福建省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖 364000）

銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)小鼠急性毒性和細(xì)胞毒性研究

李焰1,2，林香燕1，張繼欣1，尹會(huì)方1,2

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364000；2.福建省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖 364000）

文章旨在研究銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)小鼠急性毒性和細(xì)胞毒性的影響，以確保臨床用藥安全。結(jié)果表明，①急性毒性試驗(yàn)以半數(shù)致死量（LD50）和最大耐受量（MTD）為指標(biāo)，用40 g·kg-1體重劑量的銀杏葉復(fù)方制劑灌胃，7 d后小鼠未發(fā)生死亡，再在小鼠可接受的最大容積下，給小鼠灌服日累積劑量為120 g·kg-1體重的銀杏葉復(fù)方制劑進(jìn)行MTD試驗(yàn)，7 d后處死觀察其病理變化。②分別用形態(tài)學(xué)觀察法和MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，用細(xì)胞維持液將100 g·L-1銀杏葉復(fù)方制劑原液稀釋成2-n（n為1～8）8個(gè)稀釋度，測(cè)試銀杏葉復(fù)方制劑在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的體外培養(yǎng)中的最大安全質(zhì)量濃度（TC0）。結(jié)果表明，銀杏葉復(fù)方制劑LD50＞40 g·kg-1體重，MTD＞120 g·kg-1體重，小鼠無一例出現(xiàn)死亡，剖檢未見明顯肉眼可見的病理變化，說明藥物毒性很小，臨床使用安全。在形態(tài)學(xué)觀察法中，銀杏葉復(fù)方制劑在高濃度時(shí)未表現(xiàn)細(xì)胞毒性，在MTT法中銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)CEF的最大安全質(zhì)量濃度為0.78 g·L-1。

銀杏葉復(fù)方；小鼠急性毒性；雞胚成纖維細(xì)胞；細(xì)胞毒性

目前畜禽生產(chǎn)中普遍存在長(zhǎng)期大量濫用抗生素、不合理疫苗接種、應(yīng)激、病原微生物感染等問題，導(dǎo)致畜禽免疫功能下降、生產(chǎn)性能降低、引發(fā)毒副作用和藥物殘留，引發(fā)的食品安全問題屢見不鮮。因此，研究開發(fā)特性確定、高效、穩(wěn)定、無毒、無污染和無殘留的理想免疫增強(qiáng)劑將是對(duì)畜禽抗御疾病及增強(qiáng)體質(zhì)具有重要意義。天然植物性免疫增強(qiáng)劑具有無殘留、安全和免疫功效顯著等優(yōu)點(diǎn)[1]。本試驗(yàn)前期研究，利用銀杏葉與黨參、黃芪、白術(shù)等中草藥配制成銀杏葉復(fù)方制劑，研究銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)預(yù)防試驗(yàn)性脾虛證小鼠各種生理機(jī)能的影響，結(jié)果表明銀杏葉復(fù)方制劑具有提高脾虛小鼠消化酶活性、促進(jìn)腸道吸收功能和抗疲勞作用[2-3]；對(duì)脾虛證模型小鼠的免疫功能研究表明，脾虛小鼠存在神經(jīng)一內(nèi)分泌一免疫網(wǎng)絡(luò)之間的調(diào)節(jié)失衡，最終引起脾虛時(shí)機(jī)體免疫功能低下，經(jīng)銀杏葉復(fù)方制劑治療后上述免疫失調(diào)現(xiàn)象得到明顯改善[4]。本試驗(yàn)所用的銀杏葉復(fù)方制劑在前期研究的基礎(chǔ)上[2]增加砂仁和陳皮，用水煮醇提法配制而成。為確保臨床用藥安全，本試驗(yàn)對(duì)該復(fù)方進(jìn)行急性毒性、最大耐受量及細(xì)胞毒性的研究，急性毒性和最大耐受量試驗(yàn)選用小鼠作為研究對(duì)象，細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），分別用形態(tài)學(xué)觀察法和MTT兩種方法，將銀杏葉復(fù)方制劑與CEF體外共培養(yǎng)，檢測(cè)銀杏葉復(fù)方制劑的細(xì)胞毒性，測(cè)定銀杏葉復(fù)方制劑在CEF培養(yǎng)體系中的細(xì)胞安全濃度，評(píng)價(jià)其藥物毒性，為進(jìn)一步研究銀杏葉復(fù)方制劑的藥效及藥理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

銀杏葉干粉由長(zhǎng)沙博健生物科技有限公司提供，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/ADPG001-2008；黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、陳皮、砂仁購自福建紫金醫(yī)藥連鎖有限公司，質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)獸藥典（2005版）標(biāo)準(zhǔn)。銀杏葉復(fù)方制劑制備方法參照前期研究結(jié)果，制得每mL含有1 g生藥的藥液[2]，為急性毒性試驗(yàn)用。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)前將藥液濃度調(diào)整至100 g·L-1，0.22 μm濾膜過濾除菌，按2-n倍比稀釋（n為1～8），用細(xì)胞維持液分別稀釋成：50 g·L-1（2-1）、25 g·L-1（2-2）、12.5 g·L-1（2-3）、6.25 g· L-1（2-4）、3.12 g·L-1（2-5）、1.56 g·L-1（2-6）、0.78 g· L-1（2-7）、0.39 g·L-1（2-8）共8個(gè)稀釋度。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡清潔級(jí)KM種小鼠，雌性，體質(zhì)量23～26 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)2007000502350。

1.1.3 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）

10日齡雞胚，檢查正常后，按常規(guī)方法處理雞胚并經(jīng)胰蛋白酶消化后，以10%小牛血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞密度5×108個(gè)·L-1[5]。

1.1.4 試劑

細(xì)胞生長(zhǎng)液：含10%小牛血清（山東賽恩斯科技有限公司產(chǎn)品）的RPMI 1640培養(yǎng)液（HyClone公司）；細(xì)胞維持液：基本同細(xì)胞生長(zhǎng)液，但小牛血清濃度均減至2%；D-Hanks'緩沖液常規(guī)配制；MTT（四甲基偶氮唑鹽，上海捷瑞生物工程公司），用生理鹽水配制成5 g·L-1溶液。

1.1.5 儀器

3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；TH4-200型熒光倒置顯微鏡（購自日本OLYMPUS公司）；酶標(biāo)儀（購自Thermo公司）；SW-CJ-1FB型超凈工作臺(tái)（購自蘇州凈化設(shè)備有限公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning Incorporated，USA）。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)

1.2.1.1 小鼠一般癥狀觀察以及半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定方法

預(yù)試驗(yàn)找出0和100%估計(jì)致死量。試驗(yàn)取清潔級(jí)KM小鼠48只，平均隨機(jī)分成4組，第1～3組為不同劑量組，第4組為對(duì)照組。試驗(yàn)前禁食12 h，1次性灌胃給藥，給藥濃度分別為0.25、0.50和1.00 g·mL-1，對(duì)照組灌服生理鹽水，各組給藥量均為0.40 mL·10 g-1，給藥后連續(xù)觀察7 d，注意觀察小鼠的行為活動(dòng)、飲食及精神狀況，詳細(xì)記錄中毒癥狀、中毒時(shí)間、中毒持續(xù)時(shí)間以及動(dòng)物死亡時(shí)間。改良寇氏法計(jì)算LD50[6]。

1.2.1.2 小鼠最大耐受量（MTD）測(cè)定

取清潔級(jí)KM小鼠20只，采用1 g·mL-1濃度的藥物，0.4 mL·10 g-1（為體重20 g小鼠的最大給藥劑量)灌胃，1日給藥3次，每8 h一次(累積折合日用藥量為120 g·kg-1體重）。第3次給藥后2 h喂食，連續(xù)觀察7 d。第7天全部小鼠脫頸處死，剖檢，記錄心、肝、脾、肺、腎的病理變化[7]。

1.2.2 銀杏葉復(fù)方制劑體外細(xì)胞毒性測(cè)定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察法以及最大安全質(zhì)量濃度（TC0）的判斷標(biāo)準(zhǔn)

分別在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各試驗(yàn)孔加入5× 108個(gè)·L-1CEF 100 μL及各稀釋度藥物100 μL，每一濃度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)4孔不加藥物但加5×108個(gè)·L-1CEF 100 μL和100 μL細(xì)胞維持液作為細(xì)胞對(duì)照，另設(shè)4孔加200 μL細(xì)胞維持液作為空白對(duì)照。5%CO2、37℃培養(yǎng)24、48和72 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，判定藥物對(duì)細(xì)胞貼壁的影響，結(jié)果記錄為4個(gè)平行孔的平均值，以“+”、“-”表示。藥物的安全質(zhì)量濃度應(yīng)是對(duì)未貼壁的CEF無影響的最小藥物稀釋度。選擇對(duì)CEF貼壁沒有損傷的最低稀釋度為本試驗(yàn)受試藥物的最大安全質(zhì)量濃度（TC0）。判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)如下[8]：

“+++++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)最好，細(xì)胞折光性良好，全部貼壁，無空隙；“++++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)較好，細(xì)胞基本貼壁，基本無空隙；“+++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)一般，細(xì)胞貼壁少，有較多空隙和極少圓細(xì)胞；“++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)較差，有大量圓細(xì)胞和空隙；“+”表示細(xì)胞生長(zhǎng)很差，基本為圓細(xì)胞，極少貼壁細(xì)胞；“-”表示細(xì)胞生長(zhǎng)極差或無細(xì)胞生長(zhǎng)，全部為未貼壁圓細(xì)胞或細(xì)胞破碎不完整或輪廓不清無明顯可見的細(xì)胞。

1.2.2.2 MTT法以及最大安全質(zhì)量濃度（TC0）的判斷標(biāo)準(zhǔn)

待CEF長(zhǎng)成均勻單層后，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，由高到低加入不同濃度的藥物，每孔50 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)4孔，同時(shí)以相應(yīng)的同體積培養(yǎng)液代替，藥液正常細(xì)胞對(duì)照組和培養(yǎng)液空白對(duì)照組各4孔，繼續(xù)培養(yǎng)。加藥后每隔12 h觀察1次細(xì)胞單層完好程度，培養(yǎng)44 h后每孔加入MTT 100 μL，4 h后棄MTT上清液，加二甲基亞砜（DMSO）溶解液150 μL，30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的A570nm值。取4個(gè)平行孔的平均A值，計(jì)算細(xì)胞破壞百分率。

破壞率（%）=[（A細(xì)胞組-A給藥組）/（A細(xì)胞組-A空白組）]×100%[8]

選擇與細(xì)胞對(duì)照組A570nm值差異不顯著的細(xì)胞，細(xì)胞破壞率小于5%的藥物最大質(zhì)量濃度為該藥最大安全質(zhì)量濃度（TC0）。復(fù)方制劑組的A570nm值顯著大于細(xì)胞對(duì)照組時(shí)，表明該藥顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行One-Way ANOVA分析和Duncan's氏多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉復(fù)方制劑LD50的測(cè)定

各組小鼠根據(jù)表1中不同劑量一次性灌胃給藥。剛灌完藥時(shí)，小鼠精神沉郁、被毛聳立、扎堆，6 h后開始活動(dòng)，12 h后開始恢復(fù)飲水采食，1周后觀察小鼠無一死亡，活動(dòng)、飲食及精神狀況等均無異常。結(jié)果表明，當(dāng)銀杏葉復(fù)方制劑LD50＞40 g·kg-1體重，藥物毒性很小，臨床使用安全（見表1）。

2.2 小鼠最大耐受量（MTD）測(cè)定

經(jīng)MTD測(cè)定，連續(xù)觀察7 d發(fā)現(xiàn)各組小鼠全部存活，精神、食欲與對(duì)照組相比無差別，剖檢觀察小鼠各內(nèi)臟器官均無明顯病理變化，表明小鼠對(duì)該復(fù)方制劑的MTD在120 g·kg-1體重以上。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察法測(cè)定結(jié)果

銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)CEF的影響見表2和圖1～6。CEF只貼壁生長(zhǎng)繁殖，是由其細(xì)胞特性決定及試驗(yàn)過程加入血清貼壁因子所致。添加不同藥物濃度的CEF在培養(yǎng)24 h后均貼壁完全，生長(zhǎng)良好，與細(xì)胞對(duì)照組生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。72 h時(shí)藥物濃度達(dá)最高稀釋度50 g·L-1時(shí)也不影響CEF貼壁，1～8孔細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)與細(xì)胞對(duì)照組相比無差別，空白對(duì)照組無細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果表明，用形態(tài)學(xué)觀察法測(cè)定該復(fù)方制劑對(duì)CEF的最大安全質(zhì)量濃度（TC0）＞50 g·L-1，說明該藥物高濃度時(shí)未表現(xiàn)細(xì)胞毒性。

2.4 MTT法測(cè)定結(jié)果

MTT法48 h測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，當(dāng)藥物濃度低于3.12 g·L-1時(shí)，各孔吸光度值與細(xì)胞對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），藥物濃度在0.78和0.39g·L-1時(shí)，細(xì)胞破壞率為負(fù)值，且隨藥物濃度的降低，吸光度值成上升趨勢(shì)，活細(xì)胞率提高，說明在此濃度范圍內(nèi)藥物對(duì)CEF無明顯的細(xì)胞毒性；當(dāng)藥物濃度高于6.25 g·L-1時(shí)，各孔吸光度值顯著低于細(xì)胞對(duì)照組（P＜0.05），且隨藥物濃度的增加，吸光度值明顯下降，活細(xì)胞率減少，說明藥物在高濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞具有不同程度的毒性作用，隨著藥物濃度的增加毒性顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，MTT法測(cè)定該復(fù)方制劑對(duì)CEF的最大安全質(zhì)量濃度（TC0）是0.78 g·L-1。

表1 銀杏葉復(fù)方制劑LD50Table 1 Oral LD50of Ginkgo biloba compound

表2 不同藥物終濃度對(duì)CEF貼壁的影響Table 2 Effect on adherent CEF of the different concentrations(g·L-1)

圖1 銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）24 h貼壁的影響(×20)Fig.1 Effect of adherent CEF of Ginkgo biloba compound in 24 h(×20)

表3 銀杏葉復(fù)方對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果Table 3 Cytotoxicity of Ginkgo biloba compound on chick embryo fibroblast

3 討論與結(jié)論

3.1 銀杏葉復(fù)方制劑的急性毒性試驗(yàn)

劉翠艷以黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、茯苓等配制成中藥免疫增強(qiáng)劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠以40 g·kg-1體重灌胃給藥，無小鼠死亡，無法測(cè)定LD50，即LD50在40 g·kg-1體重以上；經(jīng)MTD測(cè)定，小鼠對(duì)該復(fù)方制劑的MTD在120 g·kg-1體重以上[7]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，表明銀杏葉復(fù)方制劑毒性很低。按照毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可認(rèn)為該制劑在短期內(nèi)使用安全。

3.2 銀杏葉復(fù)方制劑體外細(xì)胞毒性測(cè)定

目前國(guó)內(nèi)外一般使用MTT法和形態(tài)學(xué)觀察法對(duì)藥物的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。形態(tài)學(xué)觀察法檢測(cè)藥物毒性最為常用，在顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，藥物濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)細(xì)胞會(huì)變圓，固縮性壞死甚至脫落，但此法主觀性強(qiáng)，需要經(jīng)驗(yàn)且耗時(shí)。目前MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法在體外腫瘤細(xì)胞化療藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用越來越廣泛，成為評(píng)價(jià)藥物安全的重要指標(biāo)，檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在一定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，此法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。本試驗(yàn)分別采用形態(tài)學(xué)觀察和MTT兩種方法，比較兩種方法測(cè)定的效果，綜合兩種方法的測(cè)定結(jié)果以確定藥物的最大安全濃度，結(jié)果表明：①用形態(tài)學(xué)觀察法觀察銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)CEF的貼壁程度，高濃度時(shí)銀杏復(fù)方制劑并不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，不呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，細(xì)胞貼壁且貼壁效果與細(xì)胞對(duì)照組無明顯差異。②在MTT法中，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的降低，吸光度值增大，細(xì)胞破壞率減小。③用MTT法得到銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)CEF的最大安全濃度（TC0）是0.78 g·L-1，而在形態(tài)學(xué)觀察法中藥物的最大濃度（TC0）達(dá)50 g·L-1時(shí)也在安全濃度范圍內(nèi)，表明形態(tài)學(xué)觀察法主觀性強(qiáng)，容易對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大誤差，而MTT法相對(duì)簡(jiǎn)單直觀、準(zhǔn)確性更高，此結(jié)果可為后續(xù)體外免疫藥理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

銀杏葉復(fù)方制劑LD50＞40 g·kg-1體重，MTD＞120 g·kg-1體重，說明藥物毒性很小，臨床使用安全。在形態(tài)學(xué)觀察法中銀杏葉復(fù)方制劑在高濃度時(shí)未表現(xiàn)細(xì)胞毒性，在MTT法中銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)CEF的最大安全質(zhì)量濃度為0.78 g·L-1。

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Study on acute toxicity in mice and cytotoxicities ofGinkgo biloba compound

LI Yan1,2,LIN Xiangyan1,ZHANG Jixin1,Yin Huifang1,2(1.School of Life Science of Longyan University,Longyan Fujian 364000,China;2.Key Laboratory of Preventive veterinary medicine,Educational Commission of Fujian Province;Longyan Fujian 364000,China)

Study the acute toxicity in mice and cytotoxicities ofGinkgo bilobacompound to make sure the safety of clinical application.①The half lethal dose(LD50)and the maximum tolerance dose (MTD)were the indexes in the acute toxicity test.The mice were givenGinkgo bilobacompound through intragastric administration at the dose of 40 g·kg-1·W.The mice were still alive after 1 week, then they were given the compound at the dose of 120 g·kg-1·W.everyday at the condition of the most tolerant dose.After 1 week,the mice were killed to observe the pathological change.②The cytotoxicity tests were carried out by the morphology observation and the MTT assay.100 g·L-1ofGinkgo biloba compound was diluted into 2-n(n is from 1 to 8)with the cell maintenance medium,to test the most safety concentration(TC0)ofGinkgo bilobacompound on chick embryo fibroblast(CEF).The results showed that the acute toxicity ofGinkgo bilobacompound was very low.The LD50and MTD was above 40 g·kg-1·W.and 120 g·kg-1·W.,respectively.The mice were still alive and had no pathological change.According to the toxicity level standard,the short period use of compound was safe.Ginkgo biloba compound did not exhibit cytotoxicity at high concentrations in the morphology observation.The TC0of Ginkgo biloba compound was 0.78 g·L-1in the MTT assay.

Ginkgo biloba compound;mice acute toxicity;chick embryo fibroblast;cytotoxicity

S792.95；S816.79

A

1005-9369（2014）08-0079-05

2014-02-11

福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01142）；福建省科技廳科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011N0024）

李焰（1968-），女，教授，碩士．研究方向?yàn)轱暳咸砑觿?。E-mail:tina680605@tom.com

時(shí)間2014-7-18 14:58:44[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140718.1458.004.html

李焰,林香燕,張繼欣,等.銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)小鼠急性毒性和細(xì)胞毒性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(8):79-83.

Li Yan,Lin Xiangyan,Zhang Jixin,et al.Study on acute toxicity in mice and cytotoxicities ofGinkgo bilobacompound[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):79-83.(in Chinese with English abstract)