綿羊卵巢不同獲卵方法及體外成熟效果比較

寧方勇，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030）

綿羊卵巢不同獲卵方法及體外成熟效果比較

寧方勇，白秀娟*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030）

采用抽吸、切割和抽吸結(jié)合切割3種方法，從綿羊卵巢獲取卵母細胞，分別比較3種方法獲得A、B、C級卵母細胞的數(shù)量及耗時。結(jié)果表明，抽吸結(jié)合切割和切割法耗時分別為136.07和131.60 s，均顯著高于抽吸法61.33 s（P＜0.05）；而獲得可用卵（包括A、B級）以切割法最好為8個。對比不同激素劑量組合的3種培養(yǎng)液，均能獲得81%以上成熟率，但成熟率差異不顯著。成熟液：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes可獲得最高83.4%卵母細胞成熟率；綿羊卵巢保存在10～15℃、15～20℃和20～30℃條件下，所獲卵母細胞成熟率都在82%以上，差異不顯著；IA23187聯(lián)合6-DMAP孤雌激活體外成熟綿羊卵母細胞，可獲最高91.5%孤雌胚率。

綿羊卵巢；獲卵方法；體外成熟；比較

胚胎干細胞、轉(zhuǎn)基因、核移植及傳統(tǒng)的體外受精技術(shù)[1-5]需要大量卵母細胞和胚胎。隨著現(xiàn)代胚胎工程技術(shù)迅速發(fā)展，對綿羊卵母細胞需求量迅速增加。不斷改進現(xiàn)有卵母細胞采集方法，最大限度從屠宰綿羊卵巢獲取最大數(shù)量的優(yōu)質(zhì)卵母細胞，提高綿羊卵巢的利用效率是胚胎工程技術(shù)研究的熱點。

影響綿羊卵母細胞體外成熟因素較多，目前，綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液大部分采用穩(wěn)定性較好的TCM199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不同研究者通過添加各種離子、激素和細胞因子等獲得較高成熟率。激素在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中具有重要作用。激素在體外成熟培養(yǎng)液中添加，能顯著提高綿羊卵母細胞體外成熟成熟率，提高卵母細胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步化，所獲成熟卵母細胞在后續(xù)胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出較好發(fā)育能力。FSH、LH和雌二醇是當前各種成熟培養(yǎng)體系中應用較多，效果較為明顯的3種激素。

本試驗旨在篩選一種適合綿羊卵巢的采卵方法，確定綿羊卵巢理想保存溫度，探索保證卵母細胞成熟率的適宜激素濃度劑量組合，并確立體外成熟綿羊卵母細胞的孤雌激活方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試卵巢

綿羊卵巢采集于黑龍江省蘭西縣榆林鎮(zhèn)興達畜禽屠宰公司。

1.1.2 供試藥劑

卵巢保存液：0.9%滅菌生理鹽水、100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素；PBI操作液：NaCl 8 g·L-1、KCl 0.2 g·L-1、Na2HPO4·12H2O（或Na2HPO4）2.9 g·L-1（或1.15 g·L-1）、KH2PO40.2 g·L-1、MgCl2·6H2O 0.1 g·L-1、CaCl2·6H2O 0.13 g·L-1、葡萄糖（Glucose）1 g·L-1、丙酮酸鈉（Na-Pyrurate）0.36 g·L-1、K-penicilin 0.075 g·L-1、BSA 3 g·L-1或1 g·L-1。

SOFaa培養(yǎng)液：KCl 0.534 g·L-1、NaCl 6.294 g·L-1、KH2PO40.162 g·L-1、NaHCO32.106 g·L-1、丙酮酸鈉0.033 g·L-1、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）0.146 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.251 g·L-1、MgCl2·6H2O 0.100 g·L-1、乳酸鈉（Sodium lactate）0.370 g·L-1（或282.4 μl·L-1）、青霉素（Penicillin）0.075 g·L-1、鏈霉素0.050 g·L-1、2%（V/V）必需氨基酸、1%（V/V）非必需氨基酸。

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵巢的獲取

75%酒精消毒剪刀采集綿羊卵巢，10～35℃卵巢保存液存放，2～6 h內(nèi)運回實驗室。

1.2.2 綿羊卵母細胞的采集

1.2.2.1 綿羊卵巢的處理

用滅菌生理鹽水將采集的綿羊卵巢洗滌4～6次，如卵巢上有多余的結(jié)締組織和脂肪，用經(jīng)75%酒精消毒的手術(shù)刀剪將其剪除。卵巢處理完畢后置于卵巢保存液中采集卵母細胞，整個操作過程，需在添加雙抗的PBI液中進行。

1.2.2.2 綿羊卵母細胞的采集

采用下列3種方法進行綿羊卵母細胞的采集：

I（抽吸法）：5 mL注射器抽吸綿羊卵巢表面可見卵泡，將抽吸所得卵泡液于體式顯微鏡下挑揀卵母細胞。獲取卵母細胞移入平衡3～5 h成熟液中洗滌，然后按標準劃分卵母細胞級別，統(tǒng)計卵母細胞數(shù)量。

П（抽吸結(jié)合切割法）：先后采用I（抽吸法）和Ш（切割法）處理綿羊卵巢，將經(jīng)過兩種方法處理獲得卵母細胞按標準劃分卵母細胞級別，統(tǒng)計卵母細胞數(shù)量。

Ш（切割法）：在Φ60 mm培養(yǎng)皿中放入采卵液（PBI），將采卵綿羊卵巢置于其中。操作時，一手將卵巢用組織鑷固定后，另一只手用刀片在卵巢表面輕輕劃割，多次劃割后，用采卵液反復沖洗劃割后的卵巢。操作完畢，取出處理的綿羊卵巢，在體視顯微鏡下配合劃線法（見圖1）挑揀卵母細胞，然后按照標準劃分卵母細胞級別，并統(tǒng)計不同級別卵母細胞數(shù)量。

劃線法配合不同采集方法采集綿羊卵母細胞，是經(jīng)反復試驗證實適合卵母細胞采集的一種便捷方法。操作時，用黑色標記筆在Φ60 mm培養(yǎng)皿的皿蓋外部劃出“Z”字形線條，然后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)倒置作為卵母細胞采集容器。用不同方法對綿羊卵巢進行處理后，將含有卵母細胞的皿蓋移到顯微鏡下進行挑揀，此法不但大大提高卵母細胞的挑揀速度，而且最大程度減少了因操作失誤而造成的卵母細胞丟失，確保獲取卵母細胞數(shù)量統(tǒng)計的準確性。

圖1 劃線法Fig.1 Lineation method

卵泡液體外放置一段時間常會形成膠凍樣物質(zhì)，嚴重影響卵母細胞的收集。因此，在采集卵母細胞的過程中，每次處理完1個卵巢后，立即進行卵母細胞的挑揀。

1.2.3 綿羊卵母細胞的分級

通過不同方法獲取的綿羊卵丘—卵母細胞復合體（Cumulus-oocyte complex，COCs）用成熟液洗滌2～3次后，置于體式顯微鏡下進行等級劃分和評定。所獲卵母細胞按照形態(tài)學標準可以劃分為3個等級（參見圖2）：

A級：卵母細胞的細胞形態(tài)規(guī)則，細胞胞質(zhì)均一，卵母細胞周圍至少被3層以上卵丘細胞完全包裹，卵丘細胞致密，不擴散；

B級：卵母細胞的細胞形態(tài)良好，卵母細胞周圍被1～3層的卵丘細胞所包裹；

C級：卵母細胞周圍沒有卵丘細胞存在，變形卵和退化的卵母細胞，或者裸卵。

研究結(jié)果證實，在現(xiàn)有體外成熟培養(yǎng)體系條件下，C級卵母細胞無法體外培養(yǎng)成熟，因此只選擇A、B級卵母細胞用于體外成熟的培養(yǎng)。

圖2 卵母細胞的等級劃分Fig.2 Classification of sheep oocyte

1.2.4 綿羊卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)

1.2.4.1 綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的3種成熟液

采用如下3種成熟液對卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)：

成熟液1：TCM199-HCO3+10%FBS+1 μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

成熟液2：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+10 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

成熟液3：TCM199-HCO3+10%FBS+10 μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

1.2.4.2 綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)用卵巢的保存

分別采用10～15℃、15～20℃和20～30℃卵巢保存液保存卵巢。

1.2.5 綿羊卵母細胞成熟的判定

綿羊卵母細胞成熟包括核成熟和同步的胞質(zhì)成熟，胞質(zhì)成熟難以界定。因此，常以卵母細胞形態(tài)變化進行判別。成熟卵母細胞周圍卵丘細胞常發(fā)生放射狀排列的彌散形擴散（見圖3）。未成熟卵母細胞，其卵丘細胞仍呈成熟前與卵母細胞結(jié)合緊密狀態(tài)（見圖4）。統(tǒng)計卵母細胞成熟率以第一極體排出（見圖5）為標準。

1.2.6 成熟卵母細胞的孤雌激活

采用方法1（IA23187+6-DMAP）、方法2（Ionomycin+6-DMAP）和方法3（7%乙醇+6-DMAP）激活成熟卵母細胞。分別在5 μmol/IA23187、5 μmol·L-1離子霉素（Ionomycin）和7%乙醇的SOFaa中激活成

圖3 成熟卵母細胞Fig.3 Matured oocyte

圖4 未成熟卵母細胞Fig.4 Unmatured oocyte

圖5 第一極體排出Fig.5 Elimination of the first polar body

圖6 細胞Fig.6 Cell

2 結(jié)果與分析

2.1 不同獲卵方法獲卵效果比較

由表1可以看出，從處理卵巢所用時間看，當采用I（抽吸法）、П（抽吸結(jié)合切割法）和Ш（切割法）3種不同的采卵方法時，采集1個卵巢的卵母細熟卵母細胞5 min，再分別用濃度2 mmol·L-16-DMAP的SOFaa培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。然后用SOFaa洗滌卵母細胞3～4次，移入培養(yǎng)液SOFaa中，在5%CO2空氣、38.5℃，飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，檢查卵母細胞的2細胞（見圖6）卵裂情況，孤雌胚率為2細胞胚胎占成熟卵母細胞數(shù)的比率。胞，抽吸法耗時為61.33 s。與其比較，當采用抽吸結(jié)合切割法和切割法采集1個卵巢的卵母細胞時，耗時分別為136.07 s和131.60 s，抽吸法處理卵巢耗時顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），而抽吸結(jié)合切割法和切割法間耗時差異不顯著。

表1 不同收集卵母細胞方法的比較Table 1 Comparison of different collecting oocytes method

從所獲各級卵母細胞數(shù)量看，采用抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個卵巢時，能夠分別獲得1.37、2.00和3.97個的A級卵母細胞。A級卵母細胞獲得數(shù)，切割法要顯著的高于抽吸法和抽吸結(jié)合切割法（P＜0.05），而抽吸法與抽吸結(jié)合切割法相比差異不顯著；抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個卵巢時，B級卵母細胞獲得數(shù)分別為0.87、3.63和4.03個。B級卵母細胞獲得數(shù)，抽吸法顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），抽吸結(jié)合切割法與切割法相比差異不顯著（P＞0.05）；抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個卵巢時，C級卵母細胞的獲得數(shù)分別為0.33、2.37和2.40個。C級卵母細胞獲得數(shù)，抽吸法顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），而抽吸結(jié)合切割法與切割法相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同成熟液成熟效果比較

由表2可知，綿羊卵母細胞在3種不同培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)24 h后，成熟液1、成熟液2和成熟液3的成熟率分別為83.4%、81.1%和82.6%。經(jīng)卡方檢驗，3種成熟液體外培養(yǎng)卵母細胞的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同成熟液成熟效果比較Table 2 Influence of different maturation liquid on oocyte maturation

2.3 綿羊卵巢不同保存溫度成熟效果比較

由表3可知，綿羊離體卵巢在10～15℃、15～20℃和20～30℃條件下保存，卵母細胞的體外成熟率分別為82.5%、85.2%和82.9%。經(jīng)卡方檢驗，3種溫度條件下的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同激活液激活效果比較

由表4可知，采用方法1（IA23187+6-DMAP）、方法2（Ionomycin+6-DMAP）和方法3（7%乙醇+ 6-DMAP）激活體外成熟卵母細胞，孤雌胚率分別是91.5%、89.5%和60.5%。經(jīng)卡方檢驗，方法1與方法2的孤雌胚率差異不顯著，但方法1和方法2的孤雌胚率極顯著地高于方法3（P＜0.01）。

表3 綿羊卵巢不同保存溫度成熟效果比較Table 3 Influence of different conserved temperature for sheep ovary on oocyte maturation

表4 不同激活液激活效果比較Table 4 Comparison of different parthenogenetic activation liquid in sheep oocytes

3 討論

3.1 不同獲卵方法獲卵效果比較

采用不同方法獲取足夠數(shù)量卵母細胞對于胚胎工程技術(shù)具有重要意義，卵母細胞作為重組胚胎核受體，是核移植等胚胎工程技術(shù)操作先決條件。綿羊離體卵巢卵母細胞獲取方法主要有抽吸法、剖切（切割）法以及兩種方法相結(jié)合方法[6-8]。

本試驗中，切割法和抽吸法每處理1個卵巢耗用時間分別為：131和61 s。這與王建鋒[9]等報道的剖切（切割）法耗用時間要顯著長于抽吸法的研究結(jié)果相一致。其主要原因是在試驗操作過程中，抽吸只針對卵巢表面可見卵泡進行操作，發(fā)育成熟突出于卵巢表面的可見卵泡數(shù)量有限，而切割法需對卵巢廣泛表面反復進行操作，耗用時間較長。

本試驗中，剖切（切割）法和抽吸法處理1個卵巢時，分別能夠獲得8個和2個可用卵母細胞。這與汪立芹等切割法能夠采集2～3個可用卵母細胞研究[10]有顯著差異。綿羊發(fā)情具有季節(jié)性，綿羊卵巢在不同季節(jié)處于不同的生殖發(fā)育狀態(tài)，即使季節(jié)相同，卵泡發(fā)育進展情況也會因個體情況不同而存在較大差異。卵母細胞采集時，操作者采集卵母細胞的技術(shù)熟練程度差異較大，都是造成不同研究者卵巢獲卵數(shù)量差異較大的原因。此外，本試驗卵母細胞采集過程中配合劃線法進行輔助，減少卵母細胞的遺漏，也是卵母細胞獲取數(shù)量較為理想的原因。

Sommersberg等研究結(jié)果證實，卵母細胞成熟須在包裹卵丘細胞作用下完成[11]。體外成熟培養(yǎng)時，裸卵失去周圍卵丘細胞包裹，無法成熟。要求卵母細胞進行采集時，采集方法應盡量避免對卵母細胞周圍包裹卵丘細胞破壞。抽吸法采集卵母細胞，能夠通過更換針頭大小方法降低對卵丘細胞破壞，但當針頭型號較大時，抽吸時會在卵巢表面形成較大空洞，卵泡液中卵母細胞流失，減少獲取卵母細胞數(shù)量。

為提高卵巢的利用率，盡可能從單個卵巢獲取更多可用卵母細胞。本試驗將切割與抽吸兩種方法結(jié)合處理卵巢。從試驗結(jié)果看，切割與抽吸相結(jié)合方法在處理時間、獲得1～3層卵母細胞數(shù)與切割法相比差異均不顯著，但獲得3層以上卵母細胞數(shù)卻顯著低于切割法（P＜0.05）。這可能是在進行抽吸操作時，針頭抽吸卵泡形成較大孔洞，有部分卵母細胞隨卵泡液流出而導致丟失。因此，在耗時基本相同時，抽吸結(jié)合切割的方法不能顯著提高從卵巢上獲取卵母細胞數(shù)量。

3.2 不同成熟液成熟效果比較

哺乳動物體內(nèi)激素作用機制尚不完全清楚，激素在生物體內(nèi)通過復雜機制對生殖細胞的生長發(fā)育和凋亡起重要調(diào)控作用。進行卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時，在TCM199培養(yǎng)液基礎(chǔ)上額外添加激素[12]、各種離子[13]、細胞因子以及血清，是當前研究卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系時普遍采用的方法。檀利長等曾對比卵泡液在體外成熟培養(yǎng)時對卵母細胞成熟的促進作用，并取得較為理想的效果[14]。為了獲得較高的成熟率，激素成為當前而各種體外成熟培養(yǎng)體系中必不可少的添加物。

本試驗比較5 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇，10 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇，5 μg·mL-1FSH與10 μg·mL-1雌二醇3種組合不同激素濃度條件下，體外培養(yǎng)卵母細胞成熟情況。試驗結(jié)果證實，成熟液1可獲得最高為83.4%成熟率，成熟液2成熟率最低為81.1%，成熟液3成熟率則為82.6%。經(jīng)卡方檢驗，3種成熟液體外成熟率差異均不顯著。本試驗中，3種成熟液的卵母細胞體外成熟率都在81%以上，這與與楊志杰等報道[15]基本一致。

促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是生物體內(nèi)的糖蛋白激素，對卵母細胞生長發(fā)育和成熟都具有促進作用，能促進卵泡顆粒細胞增生，促進卵巢上卵泡生長以及雌激素合成和分泌，及刺激卵泡細胞產(chǎn)生LH受體作用。FSH能夠誘導卵丘細胞擴散，使生發(fā)泡破裂出現(xiàn)暫時性的抑制，使第一次成熟分裂時間發(fā)生改變，達到促進胞質(zhì)成熟效果。目前，F(xiàn)SH在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中的作用機制，尚未達成共識。雌二醇是動物體內(nèi)由雄激素轉(zhuǎn)化而來一類性腺類固醇激素，在生物體生殖過程中具有廣泛調(diào)節(jié)作用。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時，將FSH與LH協(xié)同添加，顯著提高卵母細胞的體外成熟率[16]。因此，當前研究動物卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)效果時，成熟液中多是不同種類的激素協(xié)同添加。

本試驗證實，體外培養(yǎng)綿羊卵母細胞，培養(yǎng)液中5 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇濃度，能滿足一定數(shù)量卵母細胞的成熟需要，獲得較高的成熟率。但綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時，F(xiàn)SH、LH和雌二醇等激素所需精確濃度仍待進一步研究確定。

3.3 卵巢保存溫度對卵母細胞成熟效果的影響

活體動物卵巢處于機體恒定內(nèi)環(huán)境中，不受外界因素影響。為保證卵巢上卵母細胞活性和發(fā)育能力，從離體卵巢獲取卵母細胞需對卵巢進行保溫，使保存溫度盡量維持恒定。

Ravindranatha認為低溫打擊能夠引起卵母細胞冷休克，并顯著降低卵母細胞發(fā)育能力[17]。潘曉燕等報道將豬卵巢保存在35℃，其卵泡液pH會隨保存時間延長不斷降低，過酸環(huán)境和代謝廢物增加卵母細胞核DNA碎片化比率，降低卵母細胞的成熟能力[18]。本試驗對比10～15℃、15～20℃和20～30℃保存綿羊離體卵巢，其卵母細胞的體外成熟率分別為82.5%、85.2%和82.9%。經(jīng)卡方檢驗，3種溫度條件下的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。試驗結(jié)果證實，卵巢保存溫度從10℃到30℃，卵母細胞成熟率不受明顯影響，隨著溫度的升高和降低，卵母細胞成熟率未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性變化。動物離體卵巢保存在適宜溫度下是卵母細胞體外成熟的重要條件，但卵巢保存的極限高、低溫，及其對卵母細胞成熟的影響仍待深入研究。

3.4 體外成熟卵母細胞的孤雌激活

正常情況下，卵母細胞由動物卵巢上排出時處于細胞周期的第二次減數(shù)分裂中期。從離體卵巢獲取的卵母細胞，只有借助外源物理或化學刺激恢復減數(shù)分裂，排出第二極體，才能繼續(xù)其細胞周期，完成發(fā)育過程。

乙醇早就被發(fā)現(xiàn)對卵母細胞具有激活作用，乙醇激活主要是通過水解細胞膜上4，5—二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生1，4，5—三磷酸肌醇（IP3），誘發(fā)細胞內(nèi)源鈣向胞質(zhì)中釋放，引起胞質(zhì)鈣離子濃度升高，激活卵母細胞[19]。本試驗利用7%乙醇對綿羊卵母細胞進行孤雌激活，僅獲60.5%孤雌胚率，低于張云生85.5%孤雌胚率[20]。本試驗7%乙醇是由卵母細胞成熟液配制而成，而張云生所用7%乙醇為SOFaa配制而成[20]，卵母細胞成熟液與培養(yǎng)用SOFaa成分差別較大，是否由此引起兩者孤雌胚率差異懸殊有待研究證實。

A23187和離子霉素都是鈣離子載體，A23187是增加Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高激活卵母細胞；離子霉素是通過動員細胞內(nèi)Ca2+釋放，依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流而引起細胞內(nèi)Ca2+升高，激活卵母細胞。A23187和離子霉素激活卵母細胞的效率均高于乙醇，單獨使用A23187和離子霉素激活時，卵母細胞無原核生成，因此A23187和離子霉素常與CHX或6-DMAP聯(lián)合使用，才能獲得理想的激活效果[21]。本試驗利用A23187激活綿羊卵母細胞，獲得91.5%孤雌胚率，雖與離子霉素89.5%孤雌胚率相比差異不顯著，但極顯著高于7%乙醇的方法（P＜0.01）。比張紅琴[22]、潘曉燕[23]等報道80%孤雌胚率高很多。這是因為本試驗所有激活卵母細胞都經(jīng)過嚴格形態(tài)學篩選，剔除形態(tài)較差的卵母細胞。成熟卵母細胞進行孤雌激活時，不但應注意激活方法選擇，更應重視激活卵母細胞篩選。

4 結(jié)論

采用切割、抽吸及切割結(jié)合抽吸3種方法從綿羊卵巢獲取卵母細胞時，切割方法獲卵效果最好，可以從1個綿羊離體卵巢上獲取8個可用卵母細胞；成熟液：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes，體外成熟培養(yǎng)卵母細胞可獲83.4%效果最好的卵母細胞成熟率；10～30℃卵巢保存溫度對其卵母細胞的體外成熟沒有顯著影響；A23187聯(lián)合6-DMAP可使成熟卵母細胞獲得91.5%的孤雌胚率，證實其具有較好的胚胎發(fā)育能力。

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Comparsion of different collecting oocytes method andin vitromatura- tion on sheep

NING Fangyong,BAI Xiujuan(School of of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The paper collected oocytes from the sheep ovary by using 3 methods:the syrine aspiration,slicing and syrine aspiration combining with slicing,and then compared the oocytes number and time consuming to acquire A,B and C standard sheep oocytes.The results showed that the time consuming are 136.07 s and 131.60 s by syrine aspiration combining with slicing and slicing method, respectively.both of them are significantly higher than the time consuming by syrine aspiration,which time is 61.33 s(P＜0.05);slicing is the best way to collect 8 available oocytes(including A and B sheep oocytes).compared the 3 kinds medium with different hormone dose,all the maturation rate is higher above 81%,however,the difference is not significant,the maturation medium:TCM199-HCO3+10% FBS+lμg·mL-1E2+2.2 g·mL-1NaHCO3+50μg·mL-1Gentamycin+5μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1Na-Pyruvate 1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes can be obtained the highest oocytes maturation rate 83.4%;83.4%;the sheep oocytes conserve in 10-15℃,15-20℃and 20-30℃,all the oocytes maturation rate is 82%above,the difference is not significant;IA23187 and 6-DMAP be used for parthenogenetic activation,parthenogenetic activation embryo rate is the highest 91.5%.

sheep oocyte;collecting oocytes method;in vitromaturation;comparsion

S826

A

1005-9369（2014）08-0065-07

2012-03-28

國家自然科學基金（30771538，31000990）

寧方勇（1977-），男，講師，博士，研究方向為特種經(jīng)濟動物。E-mail:654293748@qq.com

*通訊作者：白秀娟，教授，博士生導師，研究方向為特種經(jīng)濟動物。E-mail:bxj630306@163.com

時間2014-7-26 14:35:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1435.004.html

寧方勇,白秀娟.綿羊卵巢不同獲卵方法及體外成熟效果比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(8):65-71.

Ning Fangyong,Bai xiujuan.Comparsion of different collecting oocytes method andin vitromaturation on sheep[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):65-71.(in Chinese with English abstract)