豬沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥性分析

加春生，毛澤明，王曉楠，王俊峰，王龍，陳爽，葛蘭云，徐世文

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150088；3.哈爾濱鑫廣豐牧業(yè)有限公司，哈爾濱 150030）

豬沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥性分析

加春生1,2，毛澤明3，王曉楠2，王俊峰2，王龍2，陳爽2，葛蘭云2，徐世文1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150088；3.哈爾濱鑫廣豐牧業(yè)有限公司，哈爾濱 150030）

對哈爾濱地區(qū)規(guī)模化豬場沙門氏菌進行分離鑒定，分析其對β-內(nèi)酰胺類藥物的藥敏試驗結(jié)果及耐藥情況。采用病原菌的形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和PCR鑒定，從600份哈爾濱地區(qū)規(guī)?；i場豬直腸糞便中分離出沙門氏菌,運用Kirby-Bauer法檢測分離菌對10種β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性。結(jié)果表明，在哈爾濱地區(qū)十市縣的豬群中，沙門氏菌的總檢出率為5.83%（35/600）；不同市縣沙門氏菌的總分離率介于3.3%～18.3%；沙門氏菌的分離率與豬日齡有一定關(guān)系；對臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，對氨芐西林100%耐藥，對頭孢他啶80%耐藥，對頭孢西丁、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南存在不同程度耐藥，對碳青霉烯類敏感。結(jié)果表明，哈爾濱地區(qū)豬場存在不同程度的沙門氏菌感染，耐藥現(xiàn)象嚴重。

豬；沙門氏菌；分離鑒定；耐藥性

豬沙門氏菌病又稱豬副傷寒[1]，常發(fā)于6月齡以下的仔豬，1～4月齡多發(fā)，臨床上可分為急性（敗血癥）、亞急性和慢性3種類型，常引起較高死亡率，其中敗血型病死率達90%，慢性型病死率達25%～50%。臨床上常選擇抗生素對沙門氏菌進行預(yù)防與治療，由于β-內(nèi)酰胺類抗生素價格相對低廉，藥效獨特應(yīng)用廣泛。但豬群沙門氏菌對其產(chǎn)生耐藥性屢見報道[2]。本文對哈爾濱地區(qū)規(guī)模化豬場的豬沙門氏菌帶菌情況進行分離鑒定，研究其對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥情況，了解豬沙門氏菌的流行病學(xué)及耐藥特征，為探討防治沙門氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年8月～2012年12月，從黑龍江省哈爾濱地區(qū)的10個規(guī)?；i場，分哺乳（19～23 d）、保育（52～58 d）、生長（115～125 d）3個階段，用棉拭子采集臨床健康豬直腸糞便樣本，每個豬場60份，每個階段各采集20份，共計600份，將采集的樣品保存于4℃環(huán)境中，在24 h內(nèi)進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)及生化試驗用的各種培養(yǎng)基和沙門氏菌微量生化發(fā)酵管購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；沙門氏菌屬診斷血清購自蘭州生物制品研究所，批號20100101；參考菌株沙門氏菌等由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)家畜傳染病實驗室鑒定保存；革蘭氏染色液，營養(yǎng)肉湯、BS、SS和三糖鐵斜面瓊脂培養(yǎng)基均按文獻[3]方法制備。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

在超凈工作臺中，樣品使用生理鹽水，按100、10-1、10-2、10-3和10-4五個梯度進行稀釋。將各稀釋度的樣品，均勻涂布在BS、SS瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃孵化箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，得到單個細菌菌落。再挑取具有典型特征的疑似菌落，配制成純培養(yǎng)細菌菌液，取少量于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，將單個菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，并放于37℃恒溫空氣震蕩浴170 r·min-1中進行擴增12 h。取培養(yǎng)菌苔涂布穿刺接種三糖鐵斜面培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.4 沙門氏菌的篩選

菌落經(jīng)過分離純化后，根據(jù)革蘭氏染色后的單個細菌菌體的形態(tài)，氧化酶和發(fā)酵試驗來篩選沙門氏菌。

1.4.1 革蘭氏染色

在滅菌的載玻片的中前部滴10 μL菌液，均勻涂布，用酒精燈外焰對菌液進行固定，待冷卻后，然后進行染色。其流程如下：

①草酸錢結(jié)晶紫染色2 min，用去離子水進行沖洗；②碘液染色1 s，用去離子水進行沖洗；③95%的酒精脫色15～30 s，隨即水洗；④復(fù)染液染色2 min，水洗，直至洗下的水呈無色為止。

用吸水紙吸取多余水分，待干燥后，油鏡下觀察。呈現(xiàn)紫色的是革蘭氏陽性菌，呈現(xiàn)紅色的是革蘭氏陰性菌。將觀察到的革蘭陰性桿狀菌進行氧化酶試驗和發(fā)酵試驗進一步篩選。

1.4.2 氧化酶試驗

待檢菌用滅菌牙簽均勻涂布在氧化酶試紙上，30 s內(nèi)觀察結(jié)果，呈紫紅色的為陽性，陰性呈無色或淡黃色。沙門氏菌的氧化酶試驗呈陰性菌。

1.4.3 發(fā)酵試驗

待檢菌用接種環(huán)挑取接種到發(fā)酵微量生化管中，每株菌接種2支，取出其中一支，加入液體石蠟覆蓋，倒置，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察記錄生化管中顏色變化。不加液體石蠟的變黃色，加液體石蠟管不變色，為氧化型，兩支均變黃色則為發(fā)酵型。沙門氏菌，發(fā)酵試驗為發(fā)酵型。

1.5 沙門氏菌的鑒定

1.5.1 生化試驗

分別用分離的細菌接種三糖鐵瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察底部和斜面顏色變化以及產(chǎn)氣情況，按文獻[4]方法對所有分離株進行乳糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、M.R、吲哚、枸櫞酸鹽、V-P10項生化指標的測定。

1.5.2 沙門氏菌分離株的PCR鑒定

對分離純化菌株進行序列分析，對其進行分子鑒定。

1.5.2.1 16srDNA區(qū)的PCR擴增及序列測定

引物見表1。

表1 擴增目的基因的引物序列及目的片段長度[5]Table 1 Primer sequence and amplification length of destination fragment

反應(yīng)體系為重蒸水41 mL，10xbuffer 5 μL，上游引物l μL，下游引物1 μL，dNTP l μL，模板DNA 0.5 μL，Tap酶0.5 μL。

反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性7 min；94℃變性1 min；50℃退火l min；72℃延伸l min；共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴增及檢測：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA，其具體操作方法可以參考產(chǎn)品說明書。

發(fā)展序列測定：將PCR擴增產(chǎn)物進行16SrDNA序列測定（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成）。

1.5.2.2 16srDNA系列分析

把測序序列在GenBank（http://www.ncbi.nLm. nih.gov/）中Blast比對后，然后選取GenBank中相關(guān)序列，利用DNAstar軟件繪制進化樹和同源相似列表，確定菌株的種屬。

1.6 沙門氏菌血清群的鑒定

首先進行O抗原的鑒定，取出一塊玻板，清洗干凈，抽出10 μL不同血清群沙門氏菌O抗原單因子血清滴于一端，10 μL生理鹽水滴于另一端作對照。再在三糖鐵上斜面上挑取少量菌苔，與血清混勻，1 min內(nèi)觀察結(jié)果。通過O抗原判斷所分離的沙門氏菌屬于哪一血清群。鑒定O抗原后，再鑒定H（鞭毛）抗原，最后根據(jù)H抗原判斷沙門氏菌所屬種。

1.7 藥敏試驗

按照CLSI標準進行操作[6]，采用K-B紙片擴散法測定6類10種β-內(nèi)酰胺類抗生素作為藥物敏感性試驗用抗生素，其中包括頭霉素類（FOX）；青霉素類（AMP、PIP）；碳青霉烯類（ETP、MEC、IPM）；第三代頭孢菌素類（CAZ、CTX）；第四代頭孢菌素類（FEP）；氧頭孢烯類（ATM）。具體抗菌藥物粉劑的批號，效價及來源詳見表2。

表2 藥物敏感性試驗所用抗菌藥物粉劑的批號、效價及來源Table 2 Lot number,potency and sources of antibiotic in drug susceptibility testing

采用瓊脂平皿稀釋法測定被測菌株對CTX、CAZ和CIP的MIC值，結(jié)果按照CLSI標準進行判斷[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床健康豬直腸沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 沙門氏菌分離培養(yǎng)

經(jīng)增菌培養(yǎng)后的棉拭子樣品接種于BS和SS選擇性瓊脂平板進行純化，從其中選擇有金屬光澤的黑色、灰色或棕褐色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈棕色或黑色，有些菌株形成灰綠色的菌落，產(chǎn)生硫化氫，周圍培養(yǎng)基不變的菌落（BS），以及無色透明、細小、圓整、光滑、中心為黑色的菌落（SS）。挑取可疑菌落接種三糖鐵培養(yǎng)基，底面黃色，斜面紅色，產(chǎn)H2S涂片、革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。

2.1.2 沙門氏菌分離株生化試驗鑒定結(jié)果

分離菌株能分解葡萄糖、甘露醇、麥芽糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不利用乳糖和蔗糖；能利用枸櫞酸鹽；不分解尿素；甲基紅試驗陽性；硫化氫試驗產(chǎn)生H2S。由生化試驗結(jié)果可知分離菌株各項生化試驗指標大部分符合沙門氏菌生化特征。

2.1.3 沙門氏菌分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

對分離菌株進行沙門氏菌16SrDNA序列分析，結(jié)果見圖1。

2.2 規(guī)模豬場臨床健康豬沙門氏菌帶菌情況

采用常規(guī)法與PCR技術(shù)結(jié)合對600份樣本進行檢測，共分離到沙門氏菌35株，總檢出率為5.83%（35/600）。保育階段檢出率最高為9.44%（17/ 180），結(jié)果見表3。

可知保育階段檢出率與哺乳階段1.5%（3/200）和生長階段檢出率2%（4/200）差異均極顯著（P≤0.01），而哺乳階段與生長階段檢出率差異不顯著P＞0.05）。

圖1 35株沙門氏菌PCR擴增電泳Fig.1 PCR electrophoretogram of 35 Salmonella isolates

表3 不同飼養(yǎng)階段沙門氏菌的檢出率Table 3 Detectable rate of Salmonella in different growth phases

被調(diào)查的十個豬場中，以巴彥縣豬場檢出率最高為18.89%（17/90），結(jié)果見表4。

由結(jié)果可知巴彥縣豬場與其余九個地區(qū)豬場之間的檢出率差異均極顯著（P≤0.01），而這九個豬場之間檢出率差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 血清型分布

35株沙門氏菌共分為3種不同的血清型，其中豬霍亂沙門氏菌為最主要的血清型，共25株，占71.4%（25/35），其次為豬傷寒沙門氏菌，共8株（22.9%），鼠傷寒沙門氏菌2株（5.7%）。具體生長階段分布情況見表5，地區(qū)及豬場分布情況表6。

2.4 藥敏試驗

35株被測沙門氏菌對10種β-內(nèi)酰胺類抗生素存在不同的耐藥性，對氨芐西林均耐藥，80%對頭孢他啶耐藥，對頭孢西丁、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南存在不同程度耐藥，對厄他培南、美羅培南、亞胺培南均敏感。35株豬沙門氏菌對抗菌藥物的耐藥譜見表7。

表4 哈爾濱地區(qū)不同縣市十個豬場沙門氏菌的檢出率Table 4 Detectable rate of Salmonella in ten swine farms of different regions in Harbin Citys

表5 不同飼養(yǎng)階段沙門氏菌的血清型Table 5 Serotype of Salmonella in different growth phases

表6 哈爾濱地區(qū)不同縣市十個豬場沙門氏菌的血清型Table 6 Serotype of Salmonella in ten swine farms of different regions in Harbin Citys

表7 35株豬霍亂沙門氏菌對抗菌藥物的耐藥譜Table 7 Drug resistant tests of 35 Salmonella spp to 10 antibiotics (%)

3 討論

沙門氏菌是條件致病菌，常存于病豬各臟器及糞便中，對外界環(huán)境的抵抗力較強。當豬受其他病原感染或豬場飼養(yǎng)管理狀況不佳時，易產(chǎn)生并發(fā)癥狀[5]。Julie等對美國加州商品豬進行直腸沙門氏菌分離，檢出率為9.0%（21/228）[7]；張瑋對安徽省540份臨床健康豬直腸樣本調(diào)查，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌檢出率為4.07%（22/540）[8]。目前尚未見相關(guān)報道指出沙門氏菌的檢出率在合格范圍，本試驗使用微生物學(xué)鏡檢、生化試驗并輔助PCR方法進行鑒定，確保分離準確性。

本試驗沙門氏菌總分離率為5.83%（35/600），檢出率低于Julie研究結(jié)果[7]。與美國相比，我國使用抗菌促生長劑比例偏大，與預(yù)混料中普遍使用抗菌促生長劑[8]有關(guān)。但由于沙門氏菌在糞便中存在量少、菌株生長緩慢以及雜菌的污染嚴重等因素均可降低該菌分離率，沙門氏菌實際的感染率可能高于此結(jié)果，這也是沙門氏菌對豬群危害被低估的重要原因[9]。張瑋對安徽省6個地區(qū)豬場沙門氏菌的檢測結(jié)果顯示，檢出率的高低存在區(qū)域性[8]。本研究分離結(jié)果可見，沙門氏菌在哈爾濱地區(qū)十個市縣的豬群中廣泛存在，不同市縣的分離率除巴彥縣具有極顯著差異外，其他市縣差異不顯著。這可能與不同地區(qū)豬場飼料中抗生素的添加及添加量有關(guān)。若將飼料中的抗生素消除或減少，豬體沙門氏菌的帶菌率是否會提高尚需進一步調(diào)查研究。

任娟研究報道在豬生長過程各階段均檢出沙門氏菌，保育階段檢出率顯著高于生長和哺乳階段，認為生長階段豬的自身免疫機能健全，細菌難以在體內(nèi)長期存在，而哺乳階段仔豬得到母源抗體的保護，細菌也難以造成隱性感染，但保育階段的豬缺乏母源抗體保護，自身免疫機能尚不健全，較易受到沙門氏菌感染[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌在3個階段中均檢出，其分離率與豬日齡有關(guān)，與任娟研究結(jié)果[11]一致，以保育階段豬分離率最高，感染程度最重。哺乳和生長階段的豬沙門氏菌分離率較低（P≤0.01）。分析認為，這與動物易感性有關(guān)，由于大齡動物對沙門氏菌不易感，而保育期之前豬群相互接觸機會較少，推測仔豬在保育期大量合群時，發(fā)生相互感染。因此，對養(yǎng)殖過程每一環(huán)節(jié)嚴加管理，才能消除生豬感染沙門氏菌的機會[12]。

不合理運用抗生素，導(dǎo)致耐藥性普遍存在，使臨床上對沙門氏菌的臨床防治困難[13]。崔忠光利用13種抗菌藥物對沙門氏菌藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌對青霉素耐藥率最高達100%，對氟苯尼考耐藥率最低為12.5%，對頭孢噻吩的耐藥率為25%[14]。李淑梅通過對豫北地區(qū)規(guī)?；i場病原菌的分離及其耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌對大觀霉素、克林霉素、頭孢噻吩敏感，對紅霉素、慶大、鏈霉素、痢菌凈、阿莫西林耐藥率均較高[15]。從表6可以看出，沙門氏菌對氨芐西林100%，對頭孢他啶80%耐藥，對頭孢西丁、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南存在不同程度的耐藥，對臨床上較少應(yīng)用的藥物厄他培南、美羅培南、亞胺培南敏感，結(jié)果不一致。這可能與不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場的用藥習(xí)慣及用藥史有關(guān)，沙門氏菌是人獸共患病，如果在臨床上經(jīng)常使用同一種類的抗生素對其進行治療，導(dǎo)致沙門氏菌的耐藥性在人獸之間進行傳遞，對公共衛(wèi)生安全造成潛在威脅，臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇治療用抗菌藥物。有研究認為沙門氏菌主要產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，水解β-內(nèi)酰胺抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，是使β-內(nèi)酰胺類抗生素失去抗菌活性的主要原因[16]?？咕幬锏哪退帉?dǎo)致抗生素雖可暫時控制疫情發(fā)展或減輕畜禽病情，但停藥后復(fù)發(fā)，有效藥物漸成低效或無效藥物[17]。

4 結(jié)論

本研究從哈爾濱地區(qū)不同市縣均分離并鑒定出豬源沙門氏菌，對沙門氏菌在哈爾濱地區(qū)十個市縣豬群中的流行病學(xué)分布進行研究，發(fā)現(xiàn)在哈爾濱地區(qū)十個市縣豬群中病原攜帶與感染情況非常嚴重，在保育階段中檢出率最高。β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素如氨芐西林、頭孢他啶等是豬沙門氏菌病防治中的常用藥物，但由于長期廣泛使用，耐藥率很高，療效嚴重下降，但對于臨床應(yīng)用較少碳青霉烯類抗生素均敏感，臨床上應(yīng)根據(jù)藥敏試驗合理用藥，取得良好效果。采用交叉用藥、聯(lián)合用藥、輪換用藥，不但使療效增加，充分發(fā)揮抗生素之間協(xié)同作用，可避免沙門氏菌與某一種藥物長期接觸，使產(chǎn)生耐藥性幾率降低[18-19]。

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Identification and resistance ofSalmonellaisolated from pigs

JIA Chunsheng1,2,MAO Zeming3,WANG Xiaonan2,WANG Junfeng2,WANG Long2,CHEN Shuang2, GE Lanyun2,XU Shiwen1(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Agricultural Engineering Profession College,Harbin 150088,China;3.Harbin Xinguangfeng Husbandry Limited Company,Harbin 150030,China)

Serological identification ofSalmonellain the large-scale pig farms of Haerbin,and analyzed the differentSalmonellaantimicrobial susceptibility testresults and drug resistance.Methods Up to 35Salmonellastrains were isolated from 600 feces in the rectal of pigs by morphological observation and biochemical system.The sensitivity tests of 35 strains to 10 Beta lactam antibacterials were performedby Krby-Bauer method.These microorganisms were further confirmed by corresponding specific bio-chemistry assay and polymerase chain reaction(PCR).The reasults showed that the overall detection rate ofSalmonellawas 5.83%and the total rate of separation was from 3.3%to 18.3% in the different citys of Harbin.The resistant rate of 35 strains to ampicillin,ceftazidime,cefoxitin, piperacillin,cefotaxime,cefepime and aztreonam was 100%,80%,17%,71%,66%,6 3%and 29% respectively.However,they were still sensitive to ertapenem,meropenem and imipenem．The resultsshowed thatSalmonellainfections exist in pig farms in Harbin and the antimicrobial resistance of Salmonella is very serious.

pig;Salmonella;isolation and identification;resistance

S858.283

A

1005-9369（2014）08-0049-06

2014-03-03

國家自然科學(xué)基金項目（30170711）

加春生（1981-），男，講師，博士，研究方向為環(huán)境毒理。E-mail:jcs552@163.com

*通訊作者：徐世文，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為環(huán)境毒理，E-mail:1009598967@qq.com

時間2014-7-18 14:57:24[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140718.1457.002.html

加春生,毛澤明,王曉楠,等.豬沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(8):49-54.

Jia Chunsheng,Mao Zeming,Wang Xiaonan,et al.Identification and resistance ofSalmonellaisolated from pigs[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):49-54.(in Chinese with English abstract)