假單胞桿菌BS1 轉(zhuǎn)座突變及高產(chǎn)生物表面活性劑突變株初步篩選

侯巨梅 韓巍 國(guó)莉玲 劉銅 王彥杰

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，大慶 163319；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物研究所，大慶 163319；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院，大慶 163319）

生物表面活性劑（Biosurfactant）是從生物來(lái)源分離得到的一類具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化、增加泡沫穩(wěn)定性等表面特性的物質(zhì)，通常有親水基和親油基兩部分［1，2］。生物表面活性劑的表面活性與化學(xué)合成的表面活性劑相當(dāng)，但具有可生物降解的優(yōu)點(diǎn)，因而不會(huì)造成環(huán)境危害［3-5］。但是生物表面活性劑自被發(fā)現(xiàn)至今，由于受到較高生產(chǎn)成本的限制，只有少數(shù)產(chǎn)品走向市場(chǎng)，大多數(shù)產(chǎn)品仍處于試驗(yàn)階段，并沒(méi)有進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。特別是野生發(fā)酵菌株生物表面活性劑的產(chǎn)量非常有限，發(fā)酵生產(chǎn)的成本較高，導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)效益低于化學(xué)合成表面活性劑，最終降低其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力［6，7］。

本研究小組在前期的工作中，從大慶的油井口分離、篩選到一株性能較好產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，并通過(guò)生化指標(biāo)和16S rRNA 鑒定為假單胞桿菌BS1［8］，雖然通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化產(chǎn)生物表面活性劑的產(chǎn)量有明顯的提高，但是要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際中還存在一定的距離。因此本研究以假單胞桿菌BS1為始發(fā)菌，利用轉(zhuǎn)座突變技術(shù)構(gòu)建假單胞桿菌BS1突變體，篩選高產(chǎn)表面活性劑突變株，旨在為進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐及探索其分子代謝途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 野生型菌株假單胞桿菌BS1 為供試菌株，保存于植物病理與應(yīng)用微生物研究所。大腸桿菌（E.coli）RR1（含轉(zhuǎn)座子Tn917 的載體pTV1-OK）由美國(guó)Florida 大學(xué)Crowley 教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液 LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰化蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂18。緩沖液和高滲溶液：0.1 mol/L 磷酸二氫鈉（pH7.0）溶液為緩沖液，加入0.8 mol/L 甘露醇為高滲溶液。SMM原生質(zhì)體穩(wěn)定液（mol/L）：蔗糖0.5、MgC120.02，順丁烯二酸0.02，調(diào)pH6.5。融合劑：40%聚乙二醇（PEG-4000）的SMM 溶液。溶菌酶液用SMM 溶液配制，終濃度為1 mg/mL，過(guò)濾除菌備用。原生質(zhì)再生培養(yǎng)基：SMM 溶液加1.5% 瓊脂。產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：硝酸鈉1.5，硫酸銨1.5，磷酸氫二鉀1.0，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01，氯化鈣0.002，蒸餾水1 000 mL，液體石蠟5%，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗生素敏感性檢測(cè) 供試菌株假單胞桿菌BS1 為始發(fā)菌，分別涂布在含（0、5、10、15 和20 μg/mL）紅霉素（Erm）的LB 培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24 h，確定假單胞桿菌BS1 對(duì)紅霉素最敏感濃度。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 將供試菌株假單胞桿菌BS1 在固體LB 培養(yǎng)基上，于37℃活化24 h 后，挑取單菌落置于LB 培養(yǎng)基中于37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至菌懸液OD600=0.8 時(shí)，離心收集菌體。菌體用磷酸緩沖液沖洗后懸浮于10 mL SMM 溶液中，然后加入10 mL 溶菌酶，混勻后于37℃保溫30 min，然后用4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質(zhì)體懸浮于200 μL 高滲緩沖液中。加入1 μg 質(zhì)粒pTV1-OK 和1.8 mL 40% PEG 溶液，置36℃水浴保溫處理2 min，4 000 r/min 離心10 min，收集菌體，將沉淀充分懸浮于2 mL SMM 溶液中，將原生質(zhì)體涂布于原生質(zhì)再生平板上（含50 μg/mL Kan，10 μg/mL Erm），28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d。挑取從平板上長(zhǎng)出的菌落，即為含質(zhì)粒pTV1-OK 的菌體。

1.2.3 轉(zhuǎn)座誘變和突變體庫(kù)構(gòu)建 挑取含質(zhì)粒pTV1-OK 的轉(zhuǎn)化菌株，接種于LB 培養(yǎng)液中（50 μg/mL Kan 和10 μg/mL Erm）中，28℃搖床中培養(yǎng)（180 r/min）24 h 后取50 μL 于10 mL LB 溶液中置于41℃水浴過(guò)夜。培養(yǎng)液按1∶100 稀釋后涂布于Erm 單抗平板上進(jìn)行培養(yǎng)。將長(zhǎng)出的菌落分別點(diǎn)在Erm 單抗平板以及Erm、Kan 雙抗平板的對(duì)應(yīng)位置，挑取在雙抗平板上未長(zhǎng)而在Erm 單抗平板上長(zhǎng)出的菌落，即為轉(zhuǎn)座的菌株。按以上方法進(jìn)行多次誘導(dǎo)，并將轉(zhuǎn)座子接入含有Erm 的LB 中進(jìn)行穩(wěn)定性培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入甘油中保存，構(gòu)建假單胞桿菌BS1 轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)。

1.2.4 誘變突變體驗(yàn)證 將假單胞桿菌BS1 和突變體轉(zhuǎn)接到新鮮的LB 中培養(yǎng)，收集菌體，提取基因組，根據(jù)Tn917 序列已報(bào)道的引物Tn1：5'-AACGACGAAACTGGCTAA-3' 和Tn2：5'-AGATGGAGCTGTCGACTCAC-3' 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)［9］。PCR 反 應(yīng) 體 系（25 μL）：Premix Taq 12.5 μL，DNA 模 板1 μL， 引 物Tn1 和 Tn2 各1 μL，ddH2O 9.5 μL。 PCR 擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，52℃ 30 s，72℃ 2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 反應(yīng)后進(jìn)行1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.5 高產(chǎn)表面活性劑突變體的篩選 將假單胞桿菌BS1 和轉(zhuǎn)座突變體在牛肉膏蛋白胨斜面上活化24 h 后，用無(wú)菌水配制成菌懸液（107cfu）；然后以3%的接種量將菌懸液接種于產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基，置于30℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，4 000 r/min 離心10 min 收集上清液，進(jìn)行乳化（E24）性能測(cè)定，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［10］。假單胞桿菌BS1 為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用DPS7.05 分析。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株對(duì)抗生素敏感性檢測(cè)

供試菌株假單胞桿菌BS1 分別接種于含有0、5、10、15 和20 μg/mL 紅霉素的LB 培養(yǎng)基上。結(jié)果（圖1）顯示，假單胞桿菌BS1 在5 μg/mL 紅霉素的LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)被部分抑制，在10 μg/mL 紅霉素的LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)能夠完全被抑制，因此10 μg/mL 紅霉素被確定為最佳篩選轉(zhuǎn)座突變體的濃度。

圖1 供試菌株對(duì)紅霉素敏感性檢測(cè)

2.2 突變體的獲得

用pTV1-OK 質(zhì)粒對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含有10 μg/mL 紅霉素和50 μg/mL 卡那霉素的原生質(zhì)體再生平板上長(zhǎng)出3 個(gè)菌株，通過(guò)反復(fù)轉(zhuǎn)接抗性平板培養(yǎng)，最終獲得3 株能夠在雙抗平板上穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌株，這表明3 株轉(zhuǎn)化子含有pTV1-OK 質(zhì)粒（圖2）。挑取其中一個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座突變后，獲得了在雙抗平板上未長(zhǎng)而在Erm 單抗平板上對(duì)應(yīng)位置長(zhǎng)出的菌落（圖3），結(jié)果表明在誘導(dǎo)過(guò)程中，溫敏型的pTV1-OK 質(zhì)粒在41℃下過(guò)夜時(shí)不能復(fù)制，產(chǎn)生丟失，使菌株不能夠產(chǎn)生Kan 抗性，但是轉(zhuǎn)座子可以發(fā)生跳躍而插入到細(xì)菌的基因組，因此可以在Erm 單抗平板生長(zhǎng)。通過(guò)多次轉(zhuǎn)化試驗(yàn)一共獲得650個(gè)轉(zhuǎn)座突變體。

圖2 pTV1-OK 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

2.3 突變體PCR檢測(cè)

圖3 轉(zhuǎn)座突變體的挑選

通過(guò)提取菌株假單胞桿菌BS1 及其5 個(gè)隨機(jī)挑取的轉(zhuǎn)座突變株的總DNA，根據(jù)已知引物，對(duì)5 個(gè)突變株進(jìn)行了PCR 檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，所有突變株均能擴(kuò)增出Tn917 中一段基因的片段（1 779 bp），與預(yù)期片段大小一致，表明Tn917 已成功插入基因組中，而野生菌沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，說(shuō)明在出發(fā)菌中沒(méi)有Tn917 的插入。

圖4 PCR 驗(yàn)證Tn917 的插入

2.4 高產(chǎn)表面活性劑突變株篩選

通過(guò)對(duì)隨機(jī)挑取的24 株轉(zhuǎn)座突變體的乳化（E24）性能測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)座突變體與供試菌株的值相差不大，其中突變體T12 的E24 值達(dá)到67%，明顯高于野生菌株，結(jié)果（圖5）表明獲得一株高產(chǎn)生物表面活性劑的突變體。

3 討論

圖5 野生菌株和轉(zhuǎn)座突變體的乳化（E24）性能測(cè)定

生物表面活性劑由微生物代謝產(chǎn)生，其種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是一類由脂肪鏈和肽鏈組成的具有兩親結(jié)構(gòu)的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物——微生物脂肽。由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)和多種生物學(xué)功能，微生物脂肽在醫(yī)藥、食品、化妝品及微生物采油等多個(gè)領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用前景［11，12］。據(jù)報(bào)道，由紫紅諾卡氏菌（Nocardia rhodochrous）產(chǎn)生的海藻糖脂用于地下砂石中石油的回收，其回收率可提高30%［13］。從大慶油田分離的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）ZW-3 可產(chǎn)生的脂肽生物表面活性劑，當(dāng)使用于采油時(shí)可提高采收率912%。但是由微生物來(lái)生產(chǎn)表面活性劑普遍存在發(fā)酵步驟繁雜、產(chǎn)量低、成本高等特點(diǎn)，成為其應(yīng)用的瓶頸。

假單胞桿菌BS1 是從大慶油田分離的一株產(chǎn)鼠李糖脂的菌株，前期試驗(yàn)通過(guò)對(duì)培養(yǎng)碳源、接種量、溫度、pH 值、鹽濃度和培養(yǎng)基裝液量的條件的優(yōu)化，使其鼠李糖脂產(chǎn)生量有明顯的提高，但是相對(duì)工業(yè)要求，其產(chǎn)量相對(duì)較低，在應(yīng)用上還有一定的距離。為了更好的開(kāi)發(fā)和利用該菌株，創(chuàng)建高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的假單胞桿菌BS1 品系成為擬要解決的問(wèn)題。

轉(zhuǎn)座誘變育種是利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組方式引起基因的突變而獲得一系列的重組子，通過(guò)篩選重組子獲得符合育種目標(biāo)的菌株。它不僅具有速度快、收效大、方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠有效改善菌種特性、提高產(chǎn)品質(zhì)量和簡(jiǎn)化工藝條件等特點(diǎn)。因此目前許多優(yōu)良的微生物菌株是通過(guò)此方法獲得的。例如，Koch［14］利用轉(zhuǎn)座子誘變Pseudomonas aevuginosa 獲得了提高二倍產(chǎn)量的生物表面活性劑突變株。吳慧玲［15］利用雙親接合的方法將含有Tn5轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒導(dǎo)入丁香假單胞菌大豆致病變種中，篩選出一株產(chǎn)冠菌素比出發(fā)菌高21 倍突變株。齊勇［16］通過(guò)轉(zhuǎn)座誘導(dǎo)方法，建立了攜帶轉(zhuǎn)座子Tn917的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium1301）突變體庫(kù)，通過(guò)生物測(cè)試法篩選出產(chǎn)細(xì)胞分裂素比野生型菌株顯著提高突變體B1301-22。本研究也利用轉(zhuǎn)座突變獲得了650 個(gè)突變體庫(kù)，通過(guò)對(duì)隨機(jī)挑取的24個(gè)突變體的乳化性能測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中一株乳化性能比野生型有顯著提高。乳化性能是測(cè)定生物表面活性劑含量指標(biāo)之一，這說(shuō)明試驗(yàn)可能獲得一株高產(chǎn)表面活性劑的突變株，同時(shí)也表明轉(zhuǎn)座突變能夠快速、有效創(chuàng)建高產(chǎn)生物表面活性劑假單胞桿菌BS1新品系，為利用該菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)座誘變方法成功突變了假單胞桿菌BS1，構(gòu)建了含650 個(gè)轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)，結(jié)合PCR技術(shù)證明了Tn917 質(zhì)粒成功插入該菌基因組中。通過(guò)對(duì)隨機(jī)挑取的24 個(gè)轉(zhuǎn)座突變體的E24 值測(cè)定，獲得一株乳化性能好的突變株，其E24 值高達(dá)67%。

［1］ 陳忠喜, 郭書海, 劉廣民, 等. 除油生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其特性［J］. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 39（4）：568-588.

［2］ Kim SH, Lim EJ, Lee SO, et al. Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417［J］. Biotech Appl Biochem, 2000, 31：249-235.

［3］ 陳堅(jiān), 華兆哲, 倫世儀. 生物表面活性劑在環(huán)境生物工程中的應(yīng)用［J］. 環(huán)境科學(xué), 1996, 17（4）：84-87.

［4］ 王雨來(lái). 新穎的生物表面活性劑［J］. 新技術(shù)、新產(chǎn)品、新工藝, 2002, 28（11）：28-30.

［5］ 楊麗, 李建波. 生物表面活性劑及在油田中的應(yīng)用［J］. 內(nèi)蒙古石油化工, 2006, 2：24.

［6］ Lang S. Biological amphiphiles（microbial biosurfactant）［ J］. Curr Opini Colloid In, 2002, 7（1/2）：12-20.

［7］ 丁力孝. 脂肽生物表面活性劑的發(fā)酵生產(chǎn)及其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)研究［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2004.

［8］ Liu T, Hou JM, Zuo YH, et al. Isolation and characterization of a biosurfactant-producing bacterium from Daqing oil-contaminated sites［J］. Afr J Microbiol Res, 2011, 5（21）：3509-3514.

［9］ 陳永輝, 史賢明. 利用轉(zhuǎn)座子Tn917 構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成突變株［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2005, 45（6）：952-954.

［10］ Kiran GS, ThomasTA, Selvin J, et al. Optimization and characterization of a new lipopeptide biosurfactant produced by marine Brevibacterium aureum MSA13 in solid state culture［J］. Bioresour Technol, 2010, 101：2389-2396.

［11］ Desai JD, Banat IM. Microbial production of surfactants and their commercial potential［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 1997, 61：47-64.

［12］ Lang S, Wullbrandt D. Rhamnose lipids-biosynthesis, microbial production and application potential［J］. Appl Environ Microbiol, 1999, 1：22-32.

［13］ Rapp P, Bock H, Wager F, et al. Use of trehalose lipids in enhanced oil recovery［J］. Biotechnol, 1977, 81：177-185.

［14］ Koch AK, K?ppeli O, Fiechter A, et al. Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants［J］. J Bacteriol, 1991, 173（13）：4212-4219.

［15］ 吳慧玲, 焦睿, 章家長(zhǎng), 李如虎. Tn5 轉(zhuǎn)座誘變選育冠菌素耐高溫生產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件研究［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2009, 11（1）：62-67.

［16］ 齊勇, 黃玉杰, 李茹美, 等. 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium1301 的轉(zhuǎn)座誘變［J］. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)：自然科學(xué)版, 2008, 39（3）：407-412.