煙草根際放線菌的分離及酶活性和功能基因檢測(cè)

曹毅，陸寧，陳興江，郭玉雙，夏海乾，商勝華

（貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081）

煙草根際放線菌的分離及酶活性和功能基因檢測(cè)

曹毅，陸寧，陳興江，郭玉雙，夏海乾，商勝華*

（貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081）

從云南、貴州、河南等地采集29份煙草健田土壤樣品，采用4種土壤預(yù)處理方法及4種培養(yǎng)基分離得到607株放線菌。利用平板透明圈法對(duì)42株代表性放線菌進(jìn)行了蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和淀粉酶活性檢測(cè)；采用特異性引物擴(kuò)增法，篩選其聚酮合酶(PKS-Ⅰ、PKS-Ⅱ)基因和非核糖體多肽合成酶（NRPS）基因。對(duì)4株菌進(jìn)行16S rDNA初步分類鑒定。結(jié)果表明，供試42株放線菌中四種酶活性的初篩陽(yáng)性率為54.8%～90.5%；其中4株放線菌含三種化合物合成基因，16S rRNA序列測(cè)定4株菌均屬鏈霉菌。

煙草；根際；放線菌；酶活性；化合物合成基因

放線菌可產(chǎn)生抗生素、酶及其抑制劑等多種生物活性物質(zhì)，目前使用的抗生素中2/3來(lái)源于放線菌，在農(nóng)林生產(chǎn)和臨床醫(yī)藥上具有很大應(yīng)用價(jià)值[1-2]。土壤是放線菌的天然棲居場(chǎng)所，從中挖掘有生物活性的放線菌資源是研究重點(diǎn)。植物根系在生長(zhǎng)過(guò)程中向根際區(qū)域釋放多種分泌物，植物根際土壤與主體土壤不同，研究表明，根際區(qū)域微生物在數(shù)量上要比非根際區(qū)域微生物多19～32倍[3]，根際放線菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和其他活性物質(zhì)的比例也顯著高于非根際土壤來(lái)源的放線菌[4]，因此從植物根際土壤中分離放線菌有重要意義。

目前對(duì)植物根際放線菌系統(tǒng)研究不多，主要集中在藥用植物及一些特殊生境植物[5-6]，本研究選擇煙草根際土壤作為對(duì)象，運(yùn)用選擇性分離方法從我國(guó)主要煙草種植區(qū)健康煙田的根際土壤中分離放線菌，結(jié)合產(chǎn)酶活性檢測(cè)和重要次生代謝產(chǎn)物合成基因篩選，獲得有應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力菌株，并對(duì)有價(jià)值的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)初步鑒定，為植物根際放線菌深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

2012 年從云南、貴州、河南等地健康煙田煙草根際采集土樣29份。每份樣品分別取5～20 cm深5個(gè)穴的土壤混合,置于無(wú)菌封口袋，運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于室溫下自然風(fēng)干3周后，進(jìn)行放線菌純培養(yǎng)分離。

1.1.2 主要試劑和儀器

溶菌酶、蛋白酶K購(gòu)自sigma公司，DNA Marker及PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，引物合成及其余試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

采用四種分離培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)培養(yǎng)基（Chitinagar）、腐植酸培養(yǎng)基（HV）、脯氨酸瓊脂培養(yǎng)基（WA）和改良淀粉脯氨酸瓊脂培養(yǎng)基（MSG）。所有培養(yǎng)基滅菌后均加入萘啶酮酸25 mg·mL-1，重鉻酸鉀50 mg·mL-1，放線菌酮25 mg·mL-1以抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)；酶活性檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO40.3 g、K2HPO40.7g、Mg2SO40.5 g、FeSO40.01g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 放線菌分離方法

采用1%酚液、0.05%SDS溶液[7]、10 mmol·L-1MOPS（含0.1%未滅菌脫脂牛奶）[4]和CaCO3[8]對(duì)土樣進(jìn)行預(yù)處理，處理后的土樣采用稀釋法涂布平板，28℃培養(yǎng)，7、14、21、28 d觀察并挑取不同形態(tài)、顏色的放線菌菌落備用。

1.3 放線菌產(chǎn)酶活性檢測(cè)

參見(jiàn)文獻(xiàn)[9-10]方法檢測(cè)代表性放線菌的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性。

1.4 活性化合物合成基因陽(yáng)性菌的篩選

菌株基因組DNA的小量提取提取采用Li等[11]的方法進(jìn)行。PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS基因檢測(cè)的引物和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.516 S rRNA基因序列測(cè)定

采用細(xì)菌16S rRNA序列通用引物（27f：5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；1492r：5'GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增放線菌16S rRNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交北京諾賽基因組中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌分離結(jié)果

從云南、貴州、河南等我國(guó)主要煙草種植區(qū)采集健康煙田根際土壤29份，采用4種土壤預(yù)處理方法和4種分離培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)純化及去重復(fù)后獲得607株放線菌。本研究借鑒部分分離土壤放線菌方法對(duì)煙草根際土壤放線菌進(jìn)行篩選分離，就土壤預(yù)處理方法比較而言，CaCO3法共分離出217株放線菌，占分離菌株的35.7%；酚液處理分離出120株放線菌，占分離菌株的19.8%；MOPS法分離出109株放線菌，占分離菌株的18.0%；SDS法分離出161株放線菌，占分離菌株的26.5%。從所使用的培養(yǎng)基來(lái)看，WA、CA、HV、MSG篩選得到的放線菌分別為199、161、164、83株。

2.2 產(chǎn)酶活性菌株篩選

根據(jù)分離菌株在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，各菌株進(jìn)行初步歸類，挑選42株代表性菌株采用平板透明圈法進(jìn)行蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶4種酶活性進(jìn)行檢測(cè)（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，供試的42株放線菌中，有27株（64.3%）具有蛋白酶活性，23株（54.8%）具有幾丁質(zhì)酶活性，38株（90.5%）具有淀粉酶活性，36株（85.7%）具有纖維素酶活性；有18株菌同時(shí)產(chǎn)3種酶，11株菌同時(shí)產(chǎn)4種酶。

表1 酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of enzyme screening experiment

2.3 化合物合成基因篩選

3種化合物合成基因的篩選結(jié)果見(jiàn)圖1、2。42個(gè)菌株中，NRPS基因篩選呈陽(yáng)性的占到73.8%（31株），PKS-Ⅱ基因篩選呈陽(yáng)性的菌株占66.7%（28株），PKS-Ⅰ基因的陽(yáng)性擴(kuò)增率為21.4%（9株），3類化合物合成基因篩選呈陽(yáng)性的菌株有4株，占總數(shù)的9.5%。這些結(jié)果顯示，前2種基因的陽(yáng)性菌在所選擇的42株菌中廣泛存在。

圖1 3種化合物合成基因篩選的電泳Fig.1 PCR products of three genes

圖2 PKS-Ⅰ，PKS-Ⅱ和NRPS基因篩選陽(yáng)性菌株數(shù)量Fig.2 Numbers of isolates shown positive results in PKS-Ⅰ，PKS-Ⅱand NRPS genes screening

2.4 菌株的分子生物學(xué)初步鑒定

對(duì)3種化合物合成基因篩選均為陽(yáng)性的4株菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，用Blast程序從Genebank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索，調(diào)出相似性最高的相關(guān)菌株的16S rRNA序列，通過(guò)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

結(jié)果表明，4株菌均為鏈霉菌，其中菌株F370與暗灰鏈霉菌（Streptomycescanus）發(fā)育關(guān)系最近，F(xiàn)176與教酒鏈霉菌（Streptomyces chartreusis）發(fā)育關(guān)系最近；F478與芬氏鏈霉菌（Streptomycesfinlayi）發(fā)育關(guān)系最近，F(xiàn)471與灰平鏈霉菌（Streptomyces gris?eoplanus）發(fā)育關(guān)系最近。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 研究菌株及其從Genebank中調(diào)集的相關(guān)種以16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationships among reference strains and the isolates based on 16S rRNA gene sequences.

3 討論與結(jié)論

在煙草根際微生態(tài)環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物，受煙草根系分泌物的影響，可能產(chǎn)生從非根際放線菌中未曾挖掘和發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)。目前，系統(tǒng)研究煙草根際來(lái)源放線菌的研究不多，本研究采用

4種土壤預(yù)處理方法及4種選擇性分離培養(yǎng)基組合從我國(guó)主要植煙區(qū)的煙田根際土壤中分離、純化得到607株放線菌，從初步形態(tài)分類看，分離得到的放線菌種類較多，表明煙草根際放線菌具有多樣性，是值得深入研究和挖掘的微生物資源。

酶制劑由于其高效、專一特點(diǎn)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛用途，微生物是目前酶工業(yè)中主要材料和反應(yīng)器。不同來(lái)源放線菌是篩選和獲取酶重要資源之一，本研究篩選放線菌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶菌株在農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值，淀粉酶、纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值。供試的11株菌（26.1%）同時(shí)具有4種酶活性，從初篩結(jié)果來(lái)看，煙草根際放線菌具有廣泛酶活性。

生物活性物質(zhì)合成基因篩選，可作為快速評(píng)估細(xì)胞產(chǎn)生某類代謝物的可能性及在基因水平產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的能力，國(guó)外已將其作為發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)物的一種有效手段[14-16]。聚酮類化合物（polyketide）和非核糖體肽類（non-ribosomal pep?tides）是自然界中存在的兩類重要天然產(chǎn)物。目前已知的聚酮化合物超過(guò)1 000種，大多具有抗病原生物、抗病毒、抗腫瘤等活性，其形成的藥物幾乎已用于所有疾病的治療且已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和工業(yè)[17]；非核糖體肽（NRPs）是微生物通過(guò)非核糖體途徑、由非蛋白質(zhì)組成氨基酸參與及多種肽鏈后修飾作用合成的具有廣泛生物活性化合物。本研究對(duì)煙草根際放線菌產(chǎn)兩類化合物的關(guān)鍵合成酶基因進(jìn)行篩選，獲得了4株同時(shí)產(chǎn)含3種化合物合成基因的鏈霉菌，可為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供材料。

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CAO Yi,LU Ning,CHEN Xingjiang,GUO Yushuang, XIAHaiqian,SHANG Shenghua（Guizhou Academy of Tobacco Science,Guiyang 550081,China)

Using 4 soil pretreatment method and 4 medium,we isolated 607 strains of actinomycetes from 29 tobacco rhizosphere soil samples collected from Yunnan,Guizhou and Henan.The protease, chitinase,cellulase and amylase activity of 42 representative strains were tested byclarity circle method on plate.Genes encoding typeⅠandⅡpolyketide synthases(PKS-Ⅰ,PKS-Ⅱ),nonribosomal peptide synthase (NRPS)were screened by PCR.Four isolates were preliminary classified by its 16S rRNA gene sequences. The 42 tested strains of actinomycetes showed different enzyme activities.There were four strains showed positive results for PKS（typeⅠandⅡ）and NRPS genes screening,the four strains belongs to Streptomyces according to 16S rRNA sequence analysis.

tobacco;rhizosphere;actinomycete;enzyme activity;synthesis gene of secondary metabolite

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）02-0019-05

2012-10-24

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2012]2257號(hào))；中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目（200916、201022）

曹毅（1982-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸铩⒅参锉Ｗo(hù)。E-mail:yicao1001@163.com

商勝華，副研究員，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)。E-mail:ssh6688@sina.com

時(shí)間2014-1-17 16:42:01[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1642.017.html

曹毅,陸寧,陳興江,等.煙草根際放線菌的分離及酶活性和功能基因檢測(cè)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):19-23.

Cao Yi,Lu Ning,Chen Xingjiang,et al.Enzyme activity and functional genes detection of actinomycetes isolated from tobaccorhizosphere[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):19-23.(in Chinese with English abstract)

Enzyme activity and functional genes detection of actinomycetes isolated from tobaccorhizosphere