冷脅迫處理下冬小麥東農(nóng)冬麥1號葉片蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析

蒼晶，韓瑞，于晶，徐慶華，赫福霞，李懷偉，趙浡彤，張克儉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

冷脅迫處理下冬小麥東農(nóng)冬麥1號葉片蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析

蒼晶，韓瑞，于晶，徐慶華，赫福霞，李懷偉，趙浡彤，張克儉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

以冬小麥東農(nóng)冬麥1號為試驗(yàn)材料，將三葉期麥苗經(jīng)4℃冷脅迫處理7 d后提取葉片蛋白（25℃處理為對照組），利用雙向電泳（2-DE）技術(shù)分析差異表達(dá)蛋白。所得雙向電泳圖譜經(jīng)ImageMaster 2D Platinum 7軟件分析檢測到26個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，選取其中3個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析，所得肽段序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索比對獲得的匹配蛋白有3-磷酸甘油醛脫氫酶、ATP酶和Rubisco活化酶。這3種蛋白可能通過提高植物的光合能力、促進(jìn)植物體內(nèi)糖分的積累、改善植物對水合離子吸收等方面參與植物的抗冷機(jī)制。

冬小麥；冷脅迫；雙向電泳；差異蛋白

低溫是影響植物生長發(fā)育的一種常見非生物脅迫，在低溫條件下，植物體會(huì)受到危害，引發(fā)一系列生理生化變化。吸水能力降低，體內(nèi)水分虧缺；原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，主動(dòng)運(yùn)輸能力下降；酶活性降低，光合作用下降，植物體生長遲緩，各細(xì)胞器遭受可逆或不可逆損傷。研究表明，低溫可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。

黑龍江省地處北溫帶寒冷地區(qū)，冬季極度嚴(yán)寒，是種植冬小麥禁區(qū)，常年種植均為春小麥。由于春旱、春澇時(shí)有發(fā)生，春小麥穩(wěn)產(chǎn)性較差。東農(nóng)冬麥1號的育成填補(bǔ)了北方寒地冬小麥品種的空白，成為黑龍江省高寒地區(qū)首例可以安全越冬的冬小麥，返青率大于85%[2]。

本研究以東農(nóng)冬麥1號為試驗(yàn)材料，利用雙向電泳技術(shù)探討低溫脅迫對小麥幼苗葉片蛋白質(zhì)組變化的影響，對獲得的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜（MAL?DI-TOF-MS）鑒定，分析其相應(yīng)功能等信息與抗冷性關(guān)系，在蛋白質(zhì)水平上揭示冬小麥抗冷機(jī)制，為進(jìn)一步培育冬小麥抗寒品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

冬小麥（Triticum aestivum）品種東農(nóng)冬麥1號由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 主要儀器及試劑

Bio-Rad PROTEAN IEF Cell；Bio-Rad Power?Pac；UMAX PowerLook 2100xl掃描儀；BECKMAN Microfuge 22R Centrifuge離心機(jī)；BECKMAN大型低溫冷凍離心機(jī)等。

IPG膠條及載體兩性電解質(zhì)，購自Bio-Rad公司；尿素、硫脲、CHAPS、DTT、碘乙酰胺、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等分子試劑，購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將東農(nóng)冬麥1號種子于室溫下蒸餾水浸種12 h，發(fā)芽24 h，在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)至三葉期。取一半置4℃恒溫培養(yǎng)箱脅迫處理，另一半置25℃恒溫培養(yǎng)箱為對照，培養(yǎng)7 d后分別取兩組冬小麥葉片用于提取蛋白質(zhì)。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取

取冬小麥葉片1 g，加液氮研磨后，加入Tris飽和酚（pH 7.8）和抽提液，震蕩抽提30 min后，10 000 g，4℃，離心20 min，將酚相轉(zhuǎn)移至離心管并置于冰上。取抽提液和飽和酚加入水相，震蕩抽提30 min后，10 000 g，4℃，離心20 min，將兩次酚相混合。加入預(yù)冷的乙酸銨/甲醇溶液，Triticum aestivum震蕩后過夜沉淀酚相。所得沉淀先用乙酸銨/甲醇溶液清洗2次，再用預(yù)冷的80%丙酮清洗2次，-20℃沉淀30 min。用預(yù)冷的100%丙酮清洗沉淀，將樣品制成粉末。

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

采用Bradford法測定蛋白質(zhì)水化液的濃度[3]，電泳上樣量為500 μg。第一向等電聚焦后立即進(jìn)行平衡。先將膠條放入5 mL膠條平衡緩沖液Ⅰ（0.375 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、6 mol·L-1尿素、20%甘油、2%SDS、2%DTT）中，搖床上緩慢搖晃14 min，取出膠條吸去多余平衡液，再加5 mL膠條平衡緩沖液Ⅱ（0.375 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、6 mol·L-1尿素、20%甘油、2%SDS、25%碘乙酰胺），繼續(xù)在搖床上緩慢搖晃15 min。

第二向電泳膠濃度為12%，厚度1 mm，電泳采用恒流，初始電流20 mA，待樣品完全走出IPG膠條后（約30 min），改為40 mA，至電泳結(jié)束。

采用Coomassie-G250染色，UMAX PowerLook 2100xl掃描儀獲取圖像，掃描后圖像用ImageMas?ter 2D Platinum 7軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理組與對照組冬小麥葉片蛋白質(zhì)差異比較

經(jīng)4℃處理的冬小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜和對照組（25℃）圖譜經(jīng)軟件分析比較后，有26個(gè)差異表達(dá)顯著（上調(diào)或下調(diào)2倍以上）的蛋白質(zhì)點(diǎn)（見圖1），選取其中差異較顯著的3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)P1（上調(diào)2.53倍）、P2（下調(diào)5.67倍）和P3（下調(diào)5.51倍）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2.2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

P1、P2和P3三個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)MAL?DI-TOF-MS鑒定后，得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。

進(jìn)一步將其肽段序列與數(shù)據(jù)庫搜索比對，結(jié)果表明，P1蛋白分子質(zhì)量為37.6515 ku，等電點(diǎn)7，蛋白序列號gi|166702，為3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAP?DH），參與生物體許多生命活動(dòng)過程，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶之一；P2蛋白分子質(zhì)量為53.7421 ku，等電點(diǎn)5.68，蛋白序列號gi|29336977，是ATP酶，在植物體內(nèi)廣泛存在，能夠分解ATP釋放能量；P3蛋白分子質(zhì)量為13.0465 ku，等電點(diǎn)5.84，蛋白序列號gi|132107，是一種Rubisco活化酶，普遍存在于所有自養(yǎng)生物體內(nèi)，是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵酶（見表1）。

圖1 不同溫度處理下的冬小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳Fig.1 Proteome maps of winter wheat leaves under different temperature by 2-DE

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的PMF結(jié)果Table 1Identification of differentially expressed proteins by PMF

3 討論與結(jié)論

3.1 蛋白質(zhì)P1與冷脅迫的關(guān)系

由質(zhì)譜鑒定出P1蛋白為3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。其單體蛋白具有330個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約37 ku，廣泛存在于眾多生物體中，并且具有高度保守序列。該蛋白在細(xì)胞中含量豐富，占總蛋白的10%～20%。

GAPDH作為生物體內(nèi)一種非常重要的酶，參與生物體的許多生命活動(dòng)過程，特別是能量代謝，如糖酵解、呼吸鏈、卡爾文循環(huán)等[5]。近年來，GAPDH參與植物逆境脅迫相應(yīng)的機(jī)制正逐步得到揭示。在光照條件下，細(xì)胞可利用光能合成兩種不同類型的GAPDH，即葉綠體中的NADP+依賴型（GapAB）和胞漿中的NAD+特異型（GapC）。GapAB由GapA和GapB亞基組成，是葉綠體內(nèi)的一種標(biāo)記酶，在NADP（H）存在下起作用，參與卡爾文碳循環(huán)。在參與胞漿糖分解過程中，GapC具有嚴(yán)格的NAD+特異性，組成該酶的四種亞基可以受環(huán)境脅迫因子（如干旱、低溫和鹽）誘導(dǎo)表達(dá)或通過組成型表達(dá)的多基因所編碼。在糖分解過程中，GapAB可以在生物體中高效表達(dá)，將3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變?yōu)?，3-二磷酸甘油醛[6]。GapC屬于植物在遭受逆境脅迫后高效表達(dá)的酶類，其功能尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。在本研究中，冷脅迫下GAPDH在冬小麥葉片中表達(dá)量上調(diào)且差異顯著（上調(diào)2倍以上），說明GAPDH基因參與植物抗逆過程。研究表明，在低溫脅迫下，冬小麥體內(nèi)會(huì)積累大量糖分，耐寒品種比不耐寒品種積累更多糖類物質(zhì)[7]。而GAPDH是糖類物質(zhì)形成的關(guān)鍵酶之一，植物體通過改變體內(nèi)一些關(guān)鍵酶含量促使糖類物質(zhì)積累，從而抵御低溫脅迫。

3.2 蛋白質(zhì)P2與冷脅迫的關(guān)系

質(zhì)膜及液泡膜H+-ATP酶結(jié)構(gòu)不同但功能相同。其中質(zhì)膜H+-ATP酶活性受蛋白激酶調(diào)控，而蛋白激酶活性又受到胞質(zhì)Ca2+含量及pH影響。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，當(dāng)細(xì)胞感受到外界刺激（包括冷刺激）后，胞外及胞內(nèi)貯鈣體的Ca2+將通過鈣通道進(jìn)入胞質(zhì)[8-9]，使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度迅速升高，Ca2+與鈣調(diào)素（CaM）結(jié)合，激活相關(guān)酶（含蛋白激酶），進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)的生理生化反應(yīng)[10]。

本研究中，冷脅迫后的冬小麥葉片內(nèi)ATP酶表達(dá)量顯著下調(diào)（下調(diào)2倍以上），表明伴隨低溫，Ca2+-ATP酶活性和H+-ATP酶活性均有所下降，這直接導(dǎo)致細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+、H+穩(wěn)衡被打破，影響細(xì)胞對脅迫信號的感受，造成生理代謝紊亂。因此，ATP酶活性下降，是植物冷害產(chǎn)生的重要原因之一。

黑龍江省冬季嚴(yán)寒，大多數(shù)作物無法生存。耐寒型冬小麥東農(nóng)冬麥1號進(jìn)入冬季后，地上部分受低溫脅迫逐漸枯死，只留下地下莖部分過冬。研究表明，冬小麥東農(nóng)冬麥1號的地下莖在受到冷脅迫時(shí)，ATP酶含量有所上升[11]，說明低溫下冬小麥東農(nóng)冬麥1號地下莖呼吸作用增強(qiáng)，穩(wěn)定細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+和H+平衡，對植物過冬產(chǎn)生保護(hù)作用。

3.3 蛋白質(zhì)P3與冷脅迫的關(guān)系

由質(zhì)譜鑒定出P3蛋白為Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）。Rubisco普遍存在于所有自養(yǎng)生物中，是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵性酶，也是最豐富的蛋白質(zhì)。它參與光合作用和光呼吸過程，對凈光合速率起決定性作用[12]?？栁难h(huán)第一步反應(yīng)即由Rubisco催化RuBP（核酮糖-1，5-二磷酸）的羧化作用形成兩分子3-磷酸甘油酸。

有研究表明，植物體內(nèi)Rubisco活性及含量受環(huán)境因子影響，如光照、CO2濃度、溫度等[13]。植物為適應(yīng)高CO2濃度、低溫、低光照的環(huán)境，致使Rubisco活性和含量均下降。

已知光合作用在植物應(yīng)對低溫脅迫中起重要作用，而Rubisco是光合碳同化的關(guān)鍵酶，其活性與光合速率有很好的相關(guān)性。在本研究中，受冷脅迫的冬小麥葉片中Rubisco含量顯著下調(diào)（下調(diào)2倍以上），表明在低溫脅迫下，冬小麥光合速率受一定影響。研究表明，在低溫脅迫下，耐寒型冬小麥東農(nóng)冬麥1號體內(nèi)可溶性總糖含量有所升高[14]，而光合速率的降低則導(dǎo)致碳水化合物總量減少。其原因可能是在低溫脅迫下，光合作用產(chǎn)生的碳水化合物轉(zhuǎn)化為不溶性糖的量較少，而更多是以可溶性糖的形式積累，抵抗低溫脅迫。

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CANG Jing,HAN Rui,YU Jing,XU Qinghua, HE Fuxia,LI Huaiwei,ZHAO Botong,ZHANG Kejian（School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Total proteins from the leaves of winter wheat Dongnongdongmai 1 were extracted when seedlings at three-leaf period treated at 4℃cold stress for seven days(seedlings treated at 25℃as control),and differentially expressed proteins were analyzed by two-dimensional electrophoresis(2-DE).The 2-DE maps obtained were analyzed by ImageMaster 2D Platinum 7 software and 26 differentially expressed protein spots were detected,3 spots were selected for MALDI-TOF-MS analysis and peptide fragment sequences were searched in the database which were matched to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,ATPase and Rubisco activase.These three proteins might involved in the mechanisms of cold resistance through enhancing the photosynthetic capacity,promoting the accumulation of sugar contents and improving the absorption of hydrated ion in plants and so on.

winter wheat;cold stress;two-dimensional electrophoresis;differential protein

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）02-0001-04

蒼晶,韓瑞,于晶,等.冷脅迫處理下冬小麥東農(nóng)冬麥1號葉片蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):1-4.

Cang Jing,Han Rui,Yu Jing,et al.Analysis of expressed differential proteins in leaf of winter wheat Dongnongdongmai 1 under cold stress[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):1-4.(in Chinese with English abstract)

2012-03-26

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20112325110003）；國家自然科學(xué)基金人才培養(yǎng)能力提高科研訓(xùn)練項(xiàng)目（J1210069）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目

蒼晶（1963-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué)。E-mail:cangjing2003@163.com

時(shí)間2014-1-17 16:43:31[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1643.020.html

Analysis of expressed differential proteins in leaf of winter wheat Dongnongdongmai 1 under cold stress