分蘗洋蔥AcADLFY基因的克隆與表達分析

王 勇，鄧志園，葉陽陽，劉彬昕，陳 典

（東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

分蘗洋蔥AcADLFY基因的克隆與表達分析

王 勇，鄧志園，葉陽陽，劉彬昕，陳 典

（東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

LEAFY基因是植物開花調控網絡中的關鍵基因，影響植物的成花與開花時間。研究根據已有LEAFY同源基因保守區(qū)設計簡并引物，結合3'RACE和5'RACE，采用RT-PCR方法克隆得到分蘗洋蔥LEAFY同源基因的ORF序列，該序列長1 119 bp，編碼372個氨基酸，命名為AcADLFY，GenBank登錄號為JX275963。AcADLFY氨基酸序列含有5'-N端脯氨酸富集區(qū)、亮氨酸拉鏈結構和酸性區(qū)，符合轉錄因子的結構特征。序列分析表明，分蘗洋蔥AcADLFY基因與洋蔥的LEAFY基因高度同源，氨基酸水平上的相似性為98.66%。半定量RT-PCR結果表明，AcADLFY在幼嫩的花器官中有表達，在成熟花器官和葉片中沒有表達。試驗克隆分蘗洋蔥的LFY同源基因，為解決分蘗洋蔥的有性生殖障礙提供參考。

分蘗洋蔥；AcADLFY；克??；序列分析；基因表達

分蘗洋蔥（Allium.cape L.var.multiplcans Bailey）俗稱毛蔥、珠蔥，為百合科蔥屬植物，是洋蔥的一個變種，在自然條件下極少抽薹開花結實，主要以分生鱗莖進行繁殖[1]。分蘗洋蔥產量略低于普通洋蔥，但抗逆性強、生育期短，在不適于普通洋蔥栽培的地區(qū)和季節(jié)，可替代普通洋蔥，市場前景廣闊。此外，分蘗洋蔥具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，不僅含有蛋白質、維生素和多種礦質元素[2]，而且具有殺菌、抗腫瘤、降血壓、抗血栓及動脈硬化等生理功能[3]。由于分蘗洋蔥極少抽薹開花結實，在生產上只能用鱗莖進行繁殖，導致由一種病毒單獨侵染或幾種病毒復合侵染所引發(fā)的病害十分嚴重[4]。若能誘導分蘗洋蔥開花，以有性繁殖方式獲得定型品種，將會拓展分蘗洋蔥市場，經濟效益巨大。LEAFY是調控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉化的花序分生組織特異基因，最早被發(fā)現于1992年[5-6]。LEAFY基因協(xié)同其他花發(fā)育相關基因抑制分生組織的營養(yǎng)生長，促進花器官形成，參與花的發(fā)育[7]。

本研究以分蘗洋蔥為材料，采用同源克隆方法獲得LEAFY基因，并對其表達進行初步研究，為分蘗洋蔥的開花調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

分蘗洋蔥“Z-010”品系，由東北農業(yè)大學蔥蒜課題組提供。2011年11月將該品系鱗莖定植于溫室，至2012年6月以0.005%的GA3誘導抽薹，期間取材。

1.1.2 試劑及工具酶

Trizol（Invitrogen）、M-MLV Reverse Transcriptase、各種限制性內切酶（MBI）、TaKaRa Ex Taq?、百泰克多功能DNA純化回收試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（Trans-Gen）等，以及各種實驗室常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與基因的克隆

用Trizol（Invitrogen）法提取分蘗洋蔥抽薹初期的花序分生組織總RNA，并用逆轉錄酶（ThermoFisher，EP0441）合成cDNA第一鏈備用。于GenBank數據庫中檢索擬南芥、水仙、水稻、風信子和百合等的LFY同源基因序列，設計簡并引物AcLFYP-F和AcLFYP-R擴增中間片段。根據中間片段測序結果設計GSP3-1、GSP3-2和GSP5-1、GSP5-2四條巢式引物，結合3'-Full RACE Core Set Ver.2.0（Takara Code 6106）、5'-Full RACE Kit （Takara Code D315）使用說明進行RACE克隆。將所得片段連接到pEASY-T3載體上測序，得各片段，拼接后選取編碼框設計引物AcADLFY-F和AcADLFY-R以擴增cDNA全長。引物序列見表1。

逆轉錄及RACE操作見說明書，全長AcADLFY擴增體系及條件為：pfu Taq Buffer（Mg2+plus）2 μL，pfu Taq DNA Polymerase 0.25 μL，dNTPs mix（2 mmol·L-1）2 μL，引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補至20 μL。反應程序為：94℃，5 min；94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，1 min；72℃，10 min，30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物，并用DNA純化回收試劑盒進行目的片段回收。將回收的目的片段鏈接pEASY-T3載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，于LB固體培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選，挑取白色單菌落放入氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12 h，然后取2 mL菌夜提取質粒DNA，經酶切鑒定后送北京華大基因公司測序。

1.2.2 序列分析

克隆序列經GenBank中的BLAST進行同源序列查找，采用DNAMAN軟件進行同源性比對；使用ExPASy服務器上的ProtParam程序對序列進行理化性質的分析，CBS服務器上的SignalP 4.0、TMHMM和NPS網站上的SOPMA程序進行結構分析和功能預測。

1.2.3 AcADLFY在分蘗洋蔥中的時空表達

以RT-PCR方法分析AcADLFY在分蘗洋蔥不同時期和組織中的表達水平。分別提取分蘗洋蔥抽薹初期的葉片和花序分生組織，抽薹期的葉片、花柄、花托和小花苞，開花期的葉片、花柄、花托和花的總RNA，反轉錄成cDNA模板備用。以AcLFY-R和AcLFY-F擴增目的基因，以AcActin （GU570135）為內參基因[8]，反應體系和程序同上。

2 結果與分析

2.1 AcADLFY基因的克隆

RNA提取是基因克隆的關鍵環(huán)節(jié)，RNA質量直接影響后續(xù)試驗的成敗。RNA降解是導致RNA提取失敗的主要因素。除此之外，高等植物組織內還含有一些多糖、酚類和基因組DNA，這些物質以傳統(tǒng)RNA提取方法均很難除去[9]。

本研究使用Trizol法提取分蘗洋蔥抽薹初期花序分生組織總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S兩條帶清晰而明亮，說明所提取的總RNA純度高、片段完整，能滿足后續(xù)試驗要求（見圖1）。

表1 引物序列Table 1 Primers and their sequence

圖1 分蘗洋蔥總RNA凝膠電泳檢測結果Fig.1 Agarosegel electrophoresis of total RNA samples from tillered onions

以花序分生組織總RNA反轉錄的cDNA為模板，利用簡并引物LFYP-F和LFYP-R擴增得到一個324 bp的中間片段。根據中間片段設計RACE引物，分別從3'端和5'端擴增出一個約700 bp的序列和一個近600 bp的序列，獲得拼接結果后針對編碼區(qū)設計特異性引物AcADLFY-F和AcADLFY-R，擴增出一個1 119 bp的cDNA序列，編碼372個氨基酸。經GenBank數據庫檢索表明：該序列屬于FLOLFY超基因家族。該cDNA序列被命名為AcADLFY，已經登錄GenBank，登錄號為：JX275963。分蘗洋蔥AcADLFY基因的克隆結果如圖2所示。

2.2 AcADLFY基因氨基酸序列分析

通過ExPASy服務器上的ProtParam程序在線分析，AcADLFY氨基酸序列的分子質量為4.22 ku，等電點為8.08。經CBS服務器上的SignalP 4.0和TMHMM分析，該氨基酸序列無信號肽結構，且未形成跨膜蛋白結構域，說明AcADLFY蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白。SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/secpred-sopm.pl)對 AcADLFY蛋 白二級結構的預測結果表明，該蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，其中α螺旋、β折疊、β轉角和無規(guī)則卷曲的含量分別占39.78%、16.40%、9.68%和34.14%。另外，通過對AcADLFY氨基酸序列的觀察發(fā)現：AcADLFY基因編碼的372個氨基酸中共有23個脯氨酸，在靠近5'-N端33個氨基酸中，脯氨酸含量就高達12個，具有明顯的5'-N端脯氨酸富集區(qū)；第54～90個氨基酸之間的序列符合“XEL…XTL…XEL…”結構特征，是一個亮氨酸拉鏈結構；第68～73個氨基酸是由連續(xù)的帶負電天冬氨酸和谷氨酸組成，即酸性區(qū)。結構符合FLO-LFY超基因家族轉錄因子的結構特點。AcADLFY基因還有一個賴氨酸富集區(qū)在第155～168個氨基酸之間如圖3所示。

圖2 分蘗洋蔥AcADLFY基因的克隆結果Fig.2 Cloning result of AcADLFY from tillered onion

圖3 AcADLFY基因的cDNA序列及氨基酸序列Fig.3 AcADLFY gene cDNA sequence and the sequence of amino acids

2.3 AcADLFY基因與AcLFY基因氨基酸序列的對比分析

使用DNAMAN軟件對洋蔥和分蘗洋蔥LFY同源基因進行對比，結果表明，洋蔥AcLFY與分蘗洋蔥AcADLFY雖然在理化性質和氨基酸組成上存在一定差異，但是在序列結構上都具有轉錄因子特有的5'-N端脯氨酸富集區(qū)、亮氨酸拉鏈結構和酸性區(qū)，二級結構與三級結構亦極為相似。洋蔥與分蘗洋蔥LFY核酸序列存在6處差異，同源性高達99.46%，氨基酸序列存在5處差異，同源性為98.66%。普通洋蔥經綠體春化后，在適宜光周期條件下即可抽薹開花，而分蘗洋蔥自然狀態(tài)下難以抽薹開花，或許與這5處差異有關，結果見圖4。

2.4 分蘗洋蔥AcADLFY基因的半定量表達分析

以半定量RT-PCR方法檢測AcADLFY在不同時空的表達水平，結果如圖5所示。AcADLFY基因在抽薹初期的花序分生組織中有大量表達，在抽薹期的花柄、花托和花苞中表達較弱，其他部位幾乎檢測不到AcADLFY的表達。

圖4 AcLFY與AcADLFY氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences between AcLFY and AcADLFY

圖5 分蘗洋蔥AcADLFY基因的時空表達特性Fig.5 Spatiotemporal expression patterns of AcADLFY gene from tillered onion

3 討論與結論

本研究首次從分蘗洋蔥中克隆AcADLFY基因，序列分析證明該基因是擬南芥LEAFY基因的同源基因。目前已經從30多種高等植物中克隆得到LEAFY的同源基因[10]，其編碼區(qū)序列長度在1 080～1 314 bp，進化上較為保守，序列保守區(qū)靠近3'-C端。普通洋蔥與分蘗洋蔥的LFY基因在cDNA序列上具有高度相似性，但在表達模式上卻存在差異。洋蔥的AcLFY基因開花后主要累積于葉[11]，而分蘗洋蔥的AcADLFY基因只表達于抽薹初期的花序分生組織。研究表明，AcLFY基因存在兩個內含子序列，而AcADLFY基因沒有內含子存在，氨基酸的差異、內含子的差異、表達模式的差異或許都與二者的繁殖方式差異相關，但主導因素，或是否有其他基因參與成花調控，尚待進一步試驗論證。

不同植物之間LEAFY基因的表達模式差異較大：擬南芥中LEAFY大量存在于幼嫩的花序分生組織，在花發(fā)育完成后的營養(yǎng)器官中也有大量存在[6]；而在水仙的莖頂端分生組織和水稻的幼穗中也能檢測到大量的LEAFY基因，但在成熟的葉片中卻沒有LEAFY的表達[12-13]。AcADLFY更傾向于單子葉植物的LEAFY基因的表達模式，引起這種組織表達差異的原因還未見報道，仍需進一步研究分析。

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Cloning and expression analysis ofAcADLFYfromAllium cepavar.Aggregatum Don

WANG Yong,DENG Zhiyuan,YE Yangyang,LIU Binxin,CHEN Dian (School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

TheLEAFYgene plays a key role in the regulation network of plant flower development,it affects the flowering of plants and flowering time.According to the conserved domain of existing LEAFYhomologous gene,a pair of homologous primers was designed and the open reading frame(ORF) sequence ofLEAFYhomologous gene fromAllium cepavar.Aggregatum Don was isolated using RT-PCR method.The obtained gene was namedAcADLFY(GenBank accession No:JX275963).The AcADLFYgene contains a 1 119 bp ORF encoding 372 amino acids.The amino acid sequence contains a 5'-N proline-rich region,acidic region,which are typical structure features of transcription factor. Sequence analysis showed that theAcADLFYwas fromAllium cepavar.Aggregatum Don had a high homology withLFYfromAllium cepaL.and similarity of amino acid level was 98.66%.Semiquantitative RT-PCR analysis indicated that theAcADLFYwas detected in the young flower organs,and there was no expression in the mature flower organs and leaves.Cloning ofLFYhomologous genes fromAllium cepavar.Aggregatum Don provided a reference for resolving its sexual reproduction barriers.

Allium cepavar.Aggregatum Don;AcADLFY;cloning;sequence analysis;gene expression

S633.2；Q785

A

1005-9369（2014）03-0065-06

時間2014-3-20 17:49:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140320.1749.006.html

王勇,鄧志園,葉陽陽,等.分蘗洋蔥AcADLFY基因的克隆與表達分析[J].東北農業(yè)大學學報,2014,45(3):65-70.

Wang Yong,Deng Zhiyuan,Ye Yangyang,et al.Cloning and expression analysis ofAcADLFYfromAllium cepavar.Aggregatum Don[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):65-70.(in Chinese with English abstract)

2013-06-06

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項經費項目（200903018）

王勇（1972-），女，教授，博士，碩士生導師，研究方向為洋蔥分子育種。E-mail:lwang2002@163.com