黑龍江省水稻品種抗病基因同源序列多態(tài)性分析

鄒德堂，任月坤，王敬國，劉化龍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所，哈爾濱 150030）

黑龍江省水稻品種抗病基因同源序列多態(tài)性分析

鄒德堂，任月坤，王敬國，劉化龍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所，哈爾濱 150030）

根據(jù)60份水稻品種對45株稻瘟病菌株的抗性表現(xiàn)，結(jié)合RGA-PCR法對黑龍江省60份水稻種質(zhì)資源進行抗病性分析。結(jié)果表明，不同品種間抗病頻率變化較大，變幅為0～93.3%。以抗病基因同源序列多態(tài)性聚類，取遺傳相似系數(shù)0.680時，可將供試品種劃分為三個類群。取遺傳相似系數(shù)0.820時。類群Ⅰ可劃分3個亞類，類群Ⅱ可劃分為7個亞類，類群Ⅲ可劃分為2個亞類。以單孢菌株接種的抗性表型聚類，取相似系數(shù)0.440時，可將60個品種劃分為兩個類群。綜合利用抗病表型結(jié)合RGA分析可以更加全面地反映品種間的抗性遺傳背景，為抗病親本選育和水稻混合間栽控制稻瘟病研究提供理論依據(jù)。

稻瘟病；抗病基因；同源序列

稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)最重要的流行性病害之一，發(fā)病年份一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時高達(dá)40%～50%，部分田地甚致絕產(chǎn)[1]。自20世紀(jì)60年代以來，因氮肥施用量增加和品種抗病性減弱，黑龍江省稻瘟病每年都有不同程度發(fā)生，種植品種單一化，寄主與病原菌相互作用形成定向選擇，加之稻瘟病菌生理小種變異快，易導(dǎo)致品種的抗病性減弱甚至喪失[2]。實踐證明，探明品種間抗性來源及差異是控制稻瘟病最經(jīng)濟有效的策略。迄今，在已克隆的14個稻瘟病抗性基因中，按基因的保守結(jié)構(gòu)域進行分類，發(fā)現(xiàn)有12個稻瘟病抗性基因?qū)儆贜BS-LRR類，這類基因編碼的產(chǎn)物在氨基端都含有核苷酸結(jié)合位點（NBS），而在羧基端則都具有富亮氨酸重復(fù)序列（LRR）[3]。根據(jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計特異引物或簡并引物，通過PCR擴增同源序列DNA片段，即RGA-PCR法，為篩選抗病基因或克隆相關(guān)抗病基因提供有效手段，同時也是快速評價種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效方法[4]。

黑龍江省是中國水稻種植的北限，是寒地水稻的主要種植區(qū)域，針對水稻全省劃分為4個積溫帶，種植品種的積溫、生育期和主莖葉片數(shù)分別大致變化在2 300～2 800℃、130～150 d和10～14片葉之間。黑龍江省擁有較豐富的寒地水稻品種資源，但品種存在親緣關(guān)系近、遺傳基礎(chǔ)狹窄的致命缺點[5]。因此，明確品種抗性基因組成對于保證黑龍江省水稻安全生產(chǎn)、提高品種稻瘟病抗性均具有重要意義。本研究利用抗病基因同源序列法對黑龍江省部分骨干親本和主要育種單位的部分育成品種進行抗病遺傳基礎(chǔ)分析和稻瘟病人工接種，旨在揭示品種間抗性遺傳背景差異，為黑龍江省抗病品種合理利用和抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

試驗材料共60份，包括骨干親本4份（石狩白毛、上育397、五優(yōu)稻一號、富士光）[6]，各時期主栽品種49份，以及中國的7個稻瘟病鑒別寄主。其中除特特普、珍龍13、四豐43為秈稻，其余57個品種均為粳稻。所有水稻材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻育種實驗室提供。供試菌株于2011年秋季采集于黑龍江省11個水稻種植區(qū)，分離后獲得單孢菌株45個，經(jīng)鑒定分為6群（A、B、C、D、E、F）7個生理小種。

1.2 稻瘟病生理小種和主栽品種抗病鑒定

將中國7個稻瘟病鑒別寄主以及53個主栽水稻品種分成45個小區(qū)播種育苗，出苗后每隔3～4 d噴施營養(yǎng)液，確保稻苗茁壯生長。待稻苗長到三葉一心時分別對各小區(qū)進行稻瘟病單孢菌株噴霧接種。10 d后按Mackill等[7]評價標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各品種發(fā)病情況，將0～3級記為抗?。≧），4～5級記為感?。⊿）。并且計算每個品種的抗病頻率。抗病頻率（%）=表現(xiàn)R反應(yīng)的菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%。

1.3 DNA提取與擴增

取三葉一心時期的水稻幼葉，參照Zheng等方法[8]并稍加修改后提取水稻全基因組DNA。所用引物見表1。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為10.0 μL，包括5 μL ddH2O、1.0 μL 10×PCR Buffer、0.75 μL Mg2＋（1.0 mmol·L-1）、0.15 μL dNTPs（0.2 mmol·L-1）、0.1 μL Taq酶（5 U·μL-1）、引物1.5 μL、DNA模板1.5 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃完全延伸7 min；4℃保存。PCR反應(yīng)在Eppendorf 5333型PCR儀中進行，擴增產(chǎn)物通過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，采用Promega公司的DNA銀染系統(tǒng)進行顯色。2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)水稻品種對單孢菌株的抗感病反應(yīng)，將抗?。≧）記為“1”，感?。⊿）記為“0”。在熒光燈下讀取RGA-PCR擴增產(chǎn)物的變性聚丙烯酞胺凝膠電泳圖譜帶。根據(jù)兩次擴增譜帶的有無記錄，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”。將數(shù)據(jù)制成Microsoft Excel文件，用于聚類分析和擴增譜帶的多態(tài)性比較。數(shù)據(jù)處理采用NTSYSpcVersion2.10e（Applied Biostatistics Inc.）USA軟件中的FLEXI（Flexiblebeta method）程序進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻品種抗病性反應(yīng)

根據(jù)60份水稻品種對45個稻瘟病單孢菌株的抗感反應(yīng)，計算每個品種的抗病頻率（見表2）。品種間抗病性差異變化較大，抗病頻率在0～93.3%。龍粳14和東農(nóng)415的抗病頻率大于90%，農(nóng)林20和麗江新團黑谷的抗病頻率則為0。高抗品種8個，中抗品種33個，中感品種14個，高感品種5個。

表1 引物序列及來源Table 1 Sequence and origin of RGA primer pairs used in this research

表260 個水稻品種的抗病性Table 2 Resistance to blast of 60 rice varieties

2.2 水稻抗病基因同源序列的多態(tài)性

由RGA引物擴增的DNA片段大小在60 bp～ 3 kb，多態(tài)性譜帶主要集中在500 bp～2 kb。引物多態(tài)性信息詳見表3。選取6對引物對供試的60個水稻品種共擴增出157條清晰譜帶，其中呈多態(tài)性帶數(shù)共58條，占總帶數(shù)的36.94%。就單個品種而言，不同引物間擴增出的條帶數(shù)存在差異，引物XLRR擴增出的條帶數(shù)最多，這可能與XLRR是根據(jù)水稻抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計的有關(guān)。就引物多態(tài)性來講，其中引物S2/AS1多態(tài)性比較豐富，高達(dá)82.60%。而引物NLRR多態(tài)性則較差，只有8.96%。

2.3 基于RGA相似性對品種進行聚類

大多數(shù)RGA與抗病基因緊密連鎖，甚至就是抗病基因的一部分。因此，研究RGA在基因組中的分布和演化在一定程度上可以反映R基因的情況。根據(jù)6對RGA引物對60個品種擴增的多態(tài)性譜帶的相似系數(shù)，將6對引物單獨或組合，利用NTSYS程序進行聚類分析。將所得結(jié)果一一與稻瘟病表型聚類相比較，最終選取3對較適合稻瘟病抗性基因同源序列相似性分析的引物（RGA2/RGA5/ RGA6）組合，利用NTSYS程序進行聚類分析，結(jié)果見圖1。遺傳相似系數(shù)范圍在0.65～1.00，說明供試品種在抗性遺傳基礎(chǔ)上存在一定差異。當(dāng)相似系數(shù)取0.680時，可將60個品種劃分為3個類群。其中Ⅱ為主要類群，包括35個水稻品種。當(dāng)遺傳相似系數(shù)取0.820時，類群I又可劃分為3個亞類，其中牡丹江19單獨為一亞類，這可能與其強抗病性有關(guān)。類群II又可劃分為5個亞類，各亞類間存在一定的遺傳差異。類群Ⅲ又可劃分為2個亞類，其中三個秈稻品種珍龍13、四豐43和特特普聚在一個亞類，且與其他粳稻品種遺傳距離較大。I、II類群中都有抗病基因同源序列完全相同的品種。如I類群中的上育397和彩稻，Ⅱ類群中的東農(nóng)423、東農(nóng)425、東農(nóng)427、東農(nóng)428，說明這些供試品種在抗性遺傳上幾乎無差異?？傮w來講，類群I中抗病頻率高的品種所占比例較高，石狩白毛、合江19、牡丹江19都是各時期的高抗稻瘟病品種。同一亞類內(nèi)的品種具有相似的抗病性，如五優(yōu)稻一號、稻花香、富士光、龍稻4等品種在生產(chǎn)實踐中稻瘟病抗性表現(xiàn)均較差。另一方面，抗性基因同源序列多態(tài)性分析在一定程度上能夠反映品種間的親緣關(guān)系，如類群I中的龍粳14和綏粳7均是合江22的衍生品種。類群II中的牡丹江28、牡丹江29、牡丹江30均為黑龍江省農(nóng)科院牡丹江分院選育，幾乎都含有上育397的血緣。

2.4 基于抗稻瘟病表型聚類分析

根據(jù)水稻品種對45個單孢菌株接種抗感病反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來的數(shù)據(jù)，利用NTSYS程序進行聚類分析，結(jié)果見圖2。當(dāng)相似系數(shù)取0.440時，可將60個品種劃分為A、B兩類。A類只包括農(nóng)林20、道北43、麗江新團黒谷3個品種，麗江新團黒谷和農(nóng)林20抗病頻率最低表現(xiàn)為全感。B類包括57個水稻品種，抗病頻率22.2%～93.3%。當(dāng)相似系數(shù)取0.636時，B類又劃分為5個亞類。第ⅰ、ⅱ亞類為主要亞類，ⅰ亞類39個品種的平均抗病頻率為56.3%。ⅱ亞類15個品種的平均抗病頻率為81.0%。兩亞類之間差異明顯。

2.5 RGA相似性與水稻抗稻瘟病表型聚類比較

植物抗病性不僅決定于植物的基因型還取決于病原菌的基因型以及外部環(huán)境條件，因而品種的感病性是相對的。就水稻抗稻瘟病而言，利用同一稻瘟病單孢菌株接種不同的水稻品種明顯地表現(xiàn)出不同的抗感反應(yīng)。從本研究選用的60個水稻品種來看，用抗感單孢稻瘟病菌表型聚類，傾向于抗譜相似的聚為一類；按RGA相似性聚類，傾向于遺傳背景相近的聚為一類。RGA聚類中相同類群的品種抗病性也存在差異，如Ⅰ類群中ⅰ亞類的合江19和合江23，二者抗譜相差26.7%。II類群中ⅰ亞類的龍粳8和龍粳23，二者抗譜相差20%。這種遺傳背景相似而抗病頻率差異大情況的發(fā)生，可能是由于廣譜抗性基因存在造成的。對于抗病頻率低或是抗病頻率高的品種兩者類與類之間有較好的對應(yīng)關(guān)系，例如II類群中的ⅴ亞類與B類中的ⅰ亞類，抗病頻率低的富士光、稻花香對應(yīng)較好；B類中的ⅱ亞類和Ⅰ類部分對應(yīng)較好，如抗病頻率高的合江19、牡丹江19、龍粳14對應(yīng)較好。但總體看類與類之間沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系，不過兩者結(jié)合起來更能準(zhǔn)確反映水稻材料的抗病性遺傳背景。

表3 抗病基因同源序列引物多態(tài)性Table 3 Polymorphism of RGA primers

圖1 供試品種對3對引物的RGA指紋聚類Fig.1 Dendrogram of 60 rice cultivars based on RGA bands generated by three pairs of primers

圖2 稻瘟病抗性表型聚類Fig.2 Clustering based on phenotypes of blast resistance

3 討 論

從水稻抗稻瘟病的表型到抗病基因型，是復(fù)雜的生理生化過程，既涉及到稻瘟病菌株與水稻自身的抗性基因的互作，又涉及到稻瘟病菌株與環(huán)境之間的互作與選擇[10]。這也是同一品種在不同生育期、不同栽培管理措施下、不同生長環(huán)境中，抗性會有很大差異的原因。因此抗稻瘟病的表型聚類存在一定誤差。由此可見，抗性基因的表達(dá)受基因本身、病原菌的無毒基因和環(huán)境的影響，會產(chǎn)生R基因與表型不一致現(xiàn)象。

RGA相似性聚類與抗性表型聚類結(jié)果相比，對于抗病頻率低或抗病頻率高的品種兩者類與類之間有較好的對應(yīng)關(guān)系，但總體看來類與類之間沒有明顯的一一對應(yīng)關(guān)系，這與劉二明等研究結(jié)果一致[11]。孫雁等研究表明，用RGA多態(tài)性聚類得到的類群與其系譜來源基本相符[12]。以往研究表明，黑龍江省稻瘟病菌生理小種組成復(fù)雜，分布較廣，且年際間優(yōu)勢生理小種變化明顯。張國民等分析得出黑龍江省水稻品種遺傳變異性較小，推廣品種的抗稻瘟病基因型主要集中在少數(shù)幾個抗病基因上，如Pi-a、Pi-i、Pi-k、Pi-b和Pi-ta等[13]，因此有必要對黑龍江省抗稻瘟病種質(zhì)資源進行進一步發(fā)掘、研究與利用，明確品種的抗性基因、優(yōu)化品種布局。本研究通過RGA-PCR法從基因組水平分析水稻品種間差異，加之與稻瘟病表型結(jié)合，能更加準(zhǔn)確反映品種間的抗性遺傳背景。在進行抗性育種時，若利用已知持久抗瘟性和廣譜抗性的品種，如本研究中的東農(nóng)415、牡丹江19、合江19、龍粳14等品種，選擇與之相似系數(shù)較小、不在同一類群中、且具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品種作雜交父母本，如本研究中的稻花香、五優(yōu)稻一號等，通過單交、復(fù)交、聚合雜交等雜交方式使同一品種具有多個抗病基因組合，育成具有持久抗性的優(yōu)良品種，拓寬水稻抗病種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。此外，可通過對具有不同抗性遺傳背景的水稻品種進行合理布局，減緩水稻與稻瘟病菌之間互作，維持自然界病菌群體相對穩(wěn)定，達(dá)到持續(xù)控制稻瘟病目的[14]。

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Analysis on resistance gene analog polymorphism of rice varieties in Heilongjiang Province

ZOU Detang,REN Yuekun,WANG Jingguo,LIU Hualong(Rice Research Institute,School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Comparison of clustering analysis was investigated using spectrum of resistance to blast and polymorphism of resistance gene analog(RGA)in 60 varieties for blast resistance identification.The results showed that the resistance frequency changed greatly in different varieties, which ranged from 0-93.3%.The RGA-PCR clustering analysis showed that 60 cultivars could be divided into three groups with the genetic similarity coefficient of 0.680.GroupⅠcould be divided into three subclasses,groupⅡcould be divided into seven subclasses and GroupⅢcould be divided into two subclasses with 0.820 genetic similarity coefficient.The resistance spectrum clustering analysis showed that 60 varieties could be divided into group A and group B with the genetic similarity coefficient of 0.440.The varieties were genetically highly diversed and completely distinguished from RGA analysis and resistance analysis.Therefore,the RGA technique combining the resistance frequency,reflects the resistance in different varieties more comprehensively and provides an useful and efficient way to improve the efficiency of parent selection in rice breeding and theoretical basis for mixed cultivation of rice varieties to control rice blast.

rice disease blast;resistance gene;homologous sequence

S511

A

1005-9369（2014）03-0001-07

時間2014-3-20 17:47:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140320.1747.004.html

鄒德堂,任月坤,王敬國,等.黑龍江省水稻品種抗病基因同源序列多態(tài)性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(3):1-7.

Zou Detang,Ren Yuekun,Wang Jingguo,et al.Analysis on resistance gene analog polymorphism of rice varieties in Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):1-7.(in Chinese with English abstract)

2012-07-24

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2011BAD35B02-01）；國家科技支撐項目（2011BAD16B11）

鄒德堂（1965-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為水稻分子遺傳育種。E-mail:zoudt@163.com