番茄黃化突變體葉片蛋白雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化

李景富，徐磊,2，張賀，許向陽，趙越，齊風坤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院，黑龍江 大慶 161000）

番茄黃化突變體葉片蛋白雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化

李景富1，徐磊1,2，張賀1，許向陽1，趙越1，齊風坤1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院，黑龍江 大慶 161000）

蛋白質(zhì)提取方法和電泳條件是研究雙向電泳的關(guān)鍵。文章初步建立一套適合番茄黃化突變體葉片蛋白雙向電泳(2-DE)分析的高效提取方法及電泳條件，比較3種蛋白提取方法，篩選最適膠條范圍和上樣量。結(jié)果表明，TCA丙酮法提取的番茄黃化突變體葉片蛋白質(zhì)含量高、純度佳、分離效果好；24 cm pH 4～7 IPG膠條適于番茄黃化突變體葉片蛋白分離；1 200 μg為最佳上樣量。

番茄黃化突變體；雙向電泳；技術(shù)體系；優(yōu)化

李景富,徐磊,張賀,等.番茄黃化突變體葉片蛋白雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(4)∶46-50.

Li Jingfu,Xu Lei,Zhang He,et al.Optimization on two-dimensional electrophoresis technology system for leaves protein of tomato yellow leaf mutant[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶46-50.(in Chinese with English abstract)大多數(shù)突變體葉綠素含量低于對照植株50%。葉色突變體來源廣泛，葉色突變可自然發(fā)生，也可人工誘變。其中插入突變和基因沉默突變等是葉色突變體的主要來源[1]。

目前，國內(nèi)外已在大麥、玉米、春小麥、水稻、大豆、油菜、棉花等多種作物中發(fā)現(xiàn)或利用誘變技術(shù)創(chuàng)造此類突變體[2-3]。針對不同突變體，學者們在葉綠素含量和組成、光合能力、葉綠素熒光等方面進行大量研究，但不同突變體的研究結(jié)果不盡相同。

東北農(nóng)業(yè)大學番茄課題組于1998年在田間露地種植的中蔬4號中發(fā)現(xiàn)自然突變的番茄葉色突變株，該突變株葉色黃化，成株苗葉片有黃斑，結(jié)果前期果實發(fā)白，轉(zhuǎn)色慢，但果實能正常轉(zhuǎn)為紅色，果實硬度大。將該突變株單獨留種，經(jīng)多代自交形成遺傳穩(wěn)定的黃葉突變系。發(fā)現(xiàn)初期以果實顏色命名該突變體為番茄“白化”突變體，后更名為番茄葉色黃化突變體[4]，簡稱番茄黃化突變體，是優(yōu)良的育種材料。

蛋白質(zhì)組學是目前分離、鑒定蛋白表達差異最為有效的研究手段，該技術(shù)應(yīng)用廣泛[5]。近年來，關(guān)于植物突變體材料在蛋白質(zhì)組學方面研究越來越多，在冬小麥[6]、水稻[7]、黃瓜[8]等突變體植株上均有相關(guān)報道。

雙向電泳技術(shù)體系優(yōu)化是蛋白質(zhì)組學研究前提和基礎(chǔ)，本文針對含番茄黃化突變體的黃化現(xiàn)象，比較3種蛋白提取方法，優(yōu)化膠條范圍和上樣量選擇，初步建立一套適合番茄黃化突變體葉片蛋白雙向電泳分析的技術(shù)體系，為進一步開展番茄黃化突變體蛋白質(zhì)組學研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為番茄黃化突變體葉片，2011年4月在東北農(nóng)業(yè)大學香坊農(nóng)場實驗實習基地種植番茄黃化突變體30株，于七葉一心時摘取黃化葉片，浸入液氮中，-80℃保存，提取蛋白，用于雙向電泳分析。

1.2 蛋白質(zhì)提取方法

1.2.1 TCA丙酮法

蛋白樣品提取需在低溫下操作，方法參照Gallardo等并略作調(diào)整[9]。取適量樣品液氮研磨，研磨充分的樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，并加入3倍體積-20℃預(yù)冷的丙酮（含10.0%TCA和0.7%β-巰基乙醇），-20℃沉淀過夜；然后4℃，15 000 r·min-1離心50 min，棄上清，留沉淀，再加入80%丙酮（內(nèi)含0.07%β-巰基乙醇）去除色素及雜質(zhì)，-20℃冷藏靜置20 min；4℃，15 000 r·min-1離心30 min，棄上清，留沉淀，加入100%丙酮（內(nèi)含0.07%β-巰基乙醇），冷藏20 min。4℃，15 000 r·min-1，離心30 min，棄上清，留沉淀，重復1～2次，直到有機相成無色為止。最后一次沉淀置于-20℃凍干，使丙酮完全揮發(fā)，-80℃保存干粉。

1.2.2 Tris-base丙酮法

參照Rabillowd[10]方法略作改進。

1.2.3 Tris-HCl法提取葉總蛋白

參照谷瑞升等[11]方法提取蛋白。

1.3 蛋白質(zhì)含量測定

取蛋白質(zhì)干粉10 mg，加入200 μL裂解液[7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4.0%（W/V）CHAPS,65 mmol·L-1DTT，2.0%（V/V）IPG Buffer（pH 3～10），Mil1iQ水溶解]。先在冰浴超聲波中處理15 min，取出后在4℃搖床搖勻1 h，以上步驟重復2次，4℃，15 000 r·min-1離心50 min，取上清液，即為蛋白樣品。采用Bradford法測定蛋白濃度[12]，在紫外分光光度波長為595 nm下測定光密度OD值，繪制標準曲線，依照標準曲線計算出樣品蛋白濃度。

1.4 雙向凝膠電泳

本試驗選用24 cm pH 3～10、pH 4～7線性IPG膠條進行等電聚焦，優(yōu)化膠條pH范圍。按照GE雙向電泳操作手冊操作，蛋白上樣量分別為1 000、1 200和1 400 μg，篩選最佳上樣量。水化和聚焦在20℃自動進行，每膠條限流50 μA，總電壓時間積為99 960 vh。聚焦完畢后，膠條先在平衡液I[0.375 mol·L-1，Tris-HCl(pH 8.8)，20.0%甘油，6 mol·L-1尿素，2.0%SDS，2.0%DTT]中于搖床平衡15 min，再在平衡液Ⅱ0.375 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.8），20.0%甘油，6 mol·L-1尿素，2.0%SDS，2.0%IAA中平衡15 min,分離膠濃度選擇12.5%。第二向電泳使用GE電泳系統(tǒng)，20 mA/膠條30 min，40 mA/膠條直至溴酚藍前沿抵達凝膠底部為止。

1.5 考馬斯亮藍染色

電泳結(jié)束后將凝膠立即放入固定液中，固定1 h；再轉(zhuǎn)入Mil1iQ水中水洗3～4次，每次15 min；換置膠條考染液（R350），90℃染色20 min；10%冰乙酸脫色，直到蛋白點清晰為止。脫色后的凝膠使用ImageScanner掃描成圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法蛋白產(chǎn)量和蛋白點數(shù)比較

由表1可知，3種提取方法的總蛋白產(chǎn)量各不同，TCA丙酮法產(chǎn)量最高,達80.0 mg·g-1FW，比Tris-base丙酮法和Tris-HCl法分別高出51.5%和122.8%。從2-DE圖譜上的蛋白點總數(shù)比較，TCA丙酮法最多達（612±20）個，其次為Tris-base丙酮法達（505±24）個，Tris-HCl最少，只有（230±12）個。因此，TCA丙酮法最適合番茄黃化突變體葉片蛋白的提取。

表1 不同提取方法蛋白產(chǎn)量和2-DE圖譜中的蛋白點數(shù)Table 1 Protein yield and spots in 2-DE image of different extraction methods

2.2 不同蛋白提取方法單向SDS-PAGE凝膠圖譜分辨率的比較

應(yīng)用不同蛋白提取方法，提取相同重量番茄黃化突變體葉片的蛋白，然后以相同的蛋白上樣量進行單向電泳，其單向聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，TCA丙酮法（第1泳道）在相對分子質(zhì)量200.0～14.4 ku范圍內(nèi)提取的蛋白最全面；Tris-base丙酮法（第2泳道）在分子質(zhì)量31.0～42.7 ku范圍內(nèi)蛋白條帶較少，Tris-HCl（第3泳道）提取的蛋白在分子質(zhì)量66.4和42.7 ku附近條帶少。

圖1 3種提取方法的番茄黃化突變體葉片蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE profiles of total proteins extracted from tomato yellow leaf mutant using three methods

2.3 IPG膠條pH范圍的選擇

用寬pH范圍的3～10線性梯度膠條觀察番茄黃化突變體蛋白整體分布結(jié)果如圖2所示。從圖2中可知，蛋白等電點多數(shù)集中分布pH 4～7范圍內(nèi)，根據(jù)這一結(jié)果，進一步把2-DE圖譜分為：3≤pH＜4；4≤pH＜7；7≤pH＜10 3個區(qū)域，利用ImageMaster 2D platinum 7.0軟件檢測各區(qū)域中蛋白質(zhì)點數(shù)量，統(tǒng)計其所占比例，有91.11%蛋白點穩(wěn)定分布在4≤pH＜7區(qū)域內(nèi)。由此，確定后續(xù)試驗研究中適宜的IPG膠條pH范圍為4～7，所以確定番茄黃化突變體雙向電泳分析選用24 cm pH 4～7范圍、線性梯度的膠條。

圖2 pH范圍3～10 IPG膠條2-DE圖譜Fig.2 2-DE images from IPG strips of pH 3-10

2.4 蛋白上樣量的選擇

圖3為1 000、1 200、1 400 μg蛋白質(zhì)經(jīng)考馬斯亮藍R350染色后的2-DE圖譜。上樣量為1 000的蛋白質(zhì)圖譜（見圖3A），蛋白質(zhì)點不清晰，而且低豐度蛋白檢出量很少。上樣量為1 400 μg的蛋白質(zhì)圖譜（見圖3C），由于上樣量過大，導致高豐度蛋白面積過大，高豐度蛋白質(zhì)之間出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，覆蓋臨近的低豐度蛋白，同時也出現(xiàn)明顯的橫縱條紋。上樣量為1 200的蛋白質(zhì)圖譜（見圖3B），蛋白點分離均勻，低豐度蛋白數(shù)量也明顯增加，也加大Imagemaster 2D platinum 7.0圖像分析軟件對峰度識別的準確性，易于進行統(tǒng)計分析。據(jù)此認為，適合于番茄黃化突變體葉片蛋白質(zhì)雙向電泳的最佳的上樣量為1 200 μg。

圖3 不同上樣量雙向電泳圖譜的比較Fig.3 Comparison of 2-DE patterns of internodes using different sample load

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)提取方法

樣品制備是研究雙向電泳的關(guān)鍵。TCA丙酮法、Tris-base丙酮法、Tris-HCl法是蛋白質(zhì)提取最常用的方法。由于不同物種不同器官或組織的化學組成不同，甚至同一植物不同組織其蛋白組成不同，所以其最適蛋白質(zhì)提取方法也不同。本研究通過對上述3種蛋白質(zhì)提取方法比較得出，TCA丙酮法提取番茄黃化突變體的蛋白質(zhì)含量高、純度佳、分離效果好，在SDS-PAGE凝膠電泳中顯示的條帶數(shù)量最多、最清晰，所以TCA丙酮法適合本試驗。

3.2 膠條pH選擇

2-DE差異蛋白質(zhì)比較，選擇合適pH的IPG膠條，得到清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。本研究首先采用pH 3～10線性膠條對番茄黃化突變體蛋白質(zhì)進行分離，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)集中在pH 4～7，蛋白點間緊密相連，甚至重疊，模糊且不易區(qū)分；使用pH 4～7范圍的線性膠條進行雙向電泳分離，可提高此區(qū)域分辨率，增加該pH范圍內(nèi)檢測到的蛋白數(shù)。

3.3 上樣量選擇

上樣量大小對雙向電泳分辨率有直接作用。植物組織內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的表達豐度較低，提高樣品的上樣量有助于低豐度蛋白檢出。但等電聚焦過程中不能有太多離子，上樣量越大，鹽離子濃度越大，聚焦時電壓上升很慢甚至不能達到設(shè)定電壓，影響等點聚焦效果。另外，上樣量過大，在重泡脹期和等電聚焦時易發(fā)生蛋白質(zhì)凝聚和沉淀，產(chǎn)生水平和垂直紋理現(xiàn)象[13]。從樣品制備方法、第一向IEF等電聚焦的電壓設(shè)置、平衡時間、SDS-PAGE凝膠濃度和染色方法的靈敏度等綜合考慮，比較上樣量1 000、1 200、1 400 μg蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，當上樣量為1 200 μg時，IPG膠條各點分離清晰，圖譜質(zhì)量好。

總之，采用TCA丙酮法制備番茄黃化突變體蛋白質(zhì)干粉最佳，溶解后蛋白分離效果較好；選用24 cm，pH 4～7線性膠條得到的蛋白質(zhì)電泳圖譜最清晰，蛋白點數(shù)最多；第一向等電聚焦最適上樣量為1 200 μg，圖譜中蛋白點分離較好，圖譜清晰。

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Optimization on two-dimensional electrophoresis technology system for leaves protein of tomato yellow leaf mutant

LI Jingfu1,XU Lei1,2,ZHANG He1,XU Xiangyang1,ZHAO Yue1,QI Fengkun1
(1.School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Branch of Daqing,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Daqing Heilongjiang 161000,China)

The method of protein extraction and the conditions of electrophphoresis are the key factors in two-dimensional electrophoresis(2-DE)research.The research preliminarily selected a technology system which was the best for the two-dimensional electrophoresis(2-DE)analysis on the leave protein of tomato yellow leaf mutant through comparing three different methods of protein extractions,various ranges of the immobilized gradient strips(IPG)and different protein quantities of sample-loading.The results showed that the proteins obtained from TCA/acetone precipitation method by which the efficient protein separation were high in content and purity.24 cm pH 4-7 immobilized gradient strips(IPG)was suitable for leave protein separation of tomato yellow leaf mutant and 1 200 μg was excellent in protein quantity of sample-loading.

tomato yellow leaf mutant;two-dimensional electrophoresis;technology system; optimization

S641.2

A

1005-9369（2014）04-0046-05

時間2014-4-21 13:23:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1324.020.html

2012-03-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)專項基金（CARS-25-A-15）

李景富（1943-），男，教授，博士生導師，研究方向為蔬菜作物遺傳育種及生物技術(shù)。E-mail：Lijf_2005@126.com

葉片呈色取決于葉綠素和類胡蘿卜素比例，比值3∶1，正常葉子呈綠色。但大多數(shù)植物葉片類胡蘿卜素較葉綠素穩(wěn)定，致使葉綠素數(shù)量少，葉色突變體多呈黃色。目前報道的植物葉色突變體中，