豬細(xì)小病毒HLJ-DN株分離鑒定

劉秀芬，姜艷平，唐麗杰，李一經(jīng)*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院，湖北咸寧 437100）

豬細(xì)小病毒HLJ-DN株分離鑒定

劉秀芬1,2，姜艷平1，唐麗杰1，李一經(jīng)1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院，湖北咸寧 437100）

按照常規(guī)病毒分離方法，從黑龍江省某豬場懷孕母豬所產(chǎn)死胎的肝臟中分離到一株病毒。利用ST細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過血細(xì)胞凝集試驗、間接免疫熒光試驗及電鏡觀察等對新分離毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該病毒能在ST細(xì)胞上生長并引起明顯拉網(wǎng)狀細(xì)胞病變，按Reed-Muench法計算出TCID50為10-4.6·0.1 mL-1；通過電鏡觀察可見直徑約為20 nm無囊膜的病毒粒子，該病毒能凝集0.5%的豚鼠紅細(xì)胞，免疫熒光試驗顯示在細(xì)胞上出現(xiàn)明顯熒光，能與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)。對VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增及測序并與GenBank已發(fā)表PPV毒株序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示該毒株與WB-143株在同一個分支里，同源性高達(dá)到99.8%，說明分離的病毒為豬細(xì)小病毒，命名為HLJ-DN，該病毒的分離為研究當(dāng)?shù)刎i細(xì)小病毒的流行、預(yù)防和治療奠定。

豬細(xì)小病毒；ST細(xì)胞；分離鑒定；VP2基因

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可導(dǎo)致懷孕母豬，特別是初產(chǎn)母豬感染后產(chǎn)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡[1]。PPV是Mary等進(jìn)行豬瘟病毒（CSFV）組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)并從母豬流產(chǎn)胎兒臟器中分離得到[2]。隨后，各國分離到病毒和抗體[3-5]。

PPV有3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP3是VP2水解后的產(chǎn)物，而VP2完全重疊于VP1中。VP2是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分，含有豬細(xì)小病毒最主要的中和抗原決定簇，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是主要免疫保護(hù)性抗原[6]。VP 2的C端暴露在蛋白的表面，C段完整性是保持該蛋白二級結(jié)構(gòu)關(guān)鍵，而N端位于二級結(jié)構(gòu)內(nèi)部，利用VP 2自我包裝成空殼粒子的特性，將外源基因片段插入到N末端，用以表達(dá)外源基因，作為一種抗原的載體使用。Sedlik證實VP2暴露在外的幾個氨基酸殘基（378、383、436等）是決定病毒趨向性和毒力關(guān)鍵位點[7]，這些位點是通過與宿主的多種細(xì)胞因子而不是通過宿主細(xì)胞表面受體起作用。VP1、VP2和VP3均有免疫原性，其中VP2免疫原性最高，VP1最差[8]。

近年來豬細(xì)小病毒弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，對于控制豬細(xì)小病毒的感染和流行起積極作用。本研究從黑龍江省某發(fā)病豬場所產(chǎn)死胎中，采取常規(guī)病毒分離的方法，分離到一株疑似豬細(xì)小病毒，對該毒株進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定，命名為HLJ-DN，并對該病毒的VP2基因進(jìn)行克隆和測序，可為研究當(dāng)?shù)刎i細(xì)小病毒的流行情況及病原特征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的收集與處理

采集黑龍江某規(guī)模豬場的懷孕母豬所產(chǎn)死胎的腦、腎、肝等臟器病料，按照常規(guī)方法[9]進(jìn)行處理，過濾除菌后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及動物

鼠抗PPV血清由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物免疫實驗室保存；豚鼠購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 病毒的分離培養(yǎng)

采用傳代細(xì)胞ST進(jìn)行病毒培養(yǎng)，細(xì)胞傳代同時將1.1的濾液接種到ST細(xì)胞上，接種量為原培養(yǎng)液1/10體積，設(shè)ST細(xì)胞對照。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察，待細(xì)胞病變（CPE）量達(dá)80%以上，收獲病毒。如5～6 d無病變出現(xiàn)，再盲傳5代，若無病變，進(jìn)行PCR檢測，陰性則丟棄。

1.4 病毒的血凝試驗（HA）

將第12代病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次離心取上清作為病毒液進(jìn)行血凝試驗，方法參照文獻(xiàn)[10]，在血凝板的第一排1～12孔內(nèi)各加入50 μL生理鹽水，在第一孔內(nèi)加入50 μL病毒抗原，然后依次倍比稀釋至第11孔，最后一孔棄掉50 μL，然后每孔加入0.5%的豚鼠紅細(xì)胞，輕輕振蕩均勻，后放入37℃靜止30 min，以50%紅細(xì)胞凝集為判定終點，樣品出現(xiàn)凝集終點的最高稀釋度為該病毒的血凝價。

1.5 病毒TCID50的測定

將在ST細(xì)胞上盲傳至第12代的病毒液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基從10-1～10-10進(jìn)行梯度稀釋，按照100 μL的量接種到96孔細(xì)胞板上，ST傳代同時進(jìn)行接毒，每個稀釋度接種8個孔，并作陰性對照（未接毒的ST細(xì)胞）逐日觀察記錄CPE孔數(shù)。

1.6 病毒的免疫電鏡觀察

將病毒細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，采用液相免疫電鏡法-離心法[10]，取含病毒的待檢樣品0.2 mL、生理鹽水0.7 mL和稀釋的已知抗血清（血清為鼠抗PPV血清）0.1 mL，充分混合（抗血清用連續(xù)10倍倍比稀釋法確定適合的抗原、抗體比例）；置37℃作用1 h，然后4℃過夜；10 000～15 000 r·min-1離心30 min；去上清，最后取沉淀負(fù)染，電鏡檢查。

1.7 免疫熒光試驗

按文獻(xiàn)[9]報道的方法進(jìn)行。取接種病毒和未接種病毒60 h的細(xì)胞培養(yǎng)物，倒去培養(yǎng)上清液，刮取單層細(xì)胞培養(yǎng)物，制成細(xì)胞涂片，同鼠抗PPV血清37℃作用1 h，進(jìn)行免疫熒光染色，鏡檢觀測，并拍照記錄。

1.8 病毒的PCR鑒定

本試驗根據(jù)GenBank發(fā)表的豬細(xì)小病毒參考毒株NADL-2株VP2基因核苷酸序列，應(yīng)用Oligo 6.0及Primer5.0等軟件，設(shè)計出一對引物，進(jìn)行VP2基因的擴(kuò)增，將擴(kuò)增目的基因回收后送寶生物工程有限公司（大連）進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與GenBank已發(fā)表PPV毒株序列進(jìn)行比對分析。引物擴(kuò)增VP2基因長度為1 740 bp。引物序列如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離

病料接種ST細(xì)胞，前五代未有病變，盲傳至6代時，細(xì)胞接種病毒72 h后有明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞隨培養(yǎng)時間的加長先后呈現(xiàn)圓縮、融合、拉網(wǎng)等明顯有規(guī)律的病變，最后病變細(xì)胞開始崩解脫落，未接種病毒的的ST細(xì)胞培養(yǎng)72 h后僅見有圓縮、脫落（見圖1）。

圖1 正常ST細(xì)胞X和病變后的ST細(xì)胞YFig.1 Normal ST cells X and CPE of virus on ST cells Y

2.2 病毒的血凝試驗結(jié)果

ST細(xì)胞培養(yǎng)的第12代毒能夠凝集0.7%豚鼠紅血球，對該病毒液進(jìn)行倍比稀釋，按常規(guī)微量法進(jìn)行血凝試驗，檢測血凝效價為1∶256，如表1所示，結(jié)果表明，該培養(yǎng)液中有能夠凝集紅細(xì)胞病毒存在，且有較高血凝價。

2.3 病毒TCID50檢測結(jié)果

將HLJ-DN第12代細(xì)胞培養(yǎng)物接種于含ST細(xì)胞懸液96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)72～80 h，計算出CPE孔數(shù)，按Reed-Muench法得出TCID50為10-4.6·mL-1，說明該病毒已經(jīng)適應(yīng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)且有較高病毒滴度。

2.4 病毒的免疫電鏡結(jié)果

HLJ-DN株經(jīng)2%磷鎢酸染色在電鏡下可見聚集成團(tuán)的病毒粒子，無囊膜，呈球形或近似六角形，直徑約為20 nm，能清晰的看到病毒粒子有空殼和實心兩種（見圖2），結(jié)果顯示與豬細(xì)小病毒正常形態(tài)相符。

表1 血凝試驗結(jié)果Table 1 Result of HAT

圖2 HLJ-DN分離株免疫電鏡結(jié)果Fig.2 Result of immunity electron microscope of isolated virus

2.5 免疫熒光試驗

應(yīng)用鼠抗PPV的免疫血清對接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物和未接種病毒的對照細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行間接免疫熒光試驗，結(jié)果表明，接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物多數(shù)細(xì)胞在其胞漿和細(xì)胞膜上出現(xiàn)綠色閃亮熒光；正常的細(xì)胞未見有綠色熒光（見圖3）。

圖3 接種病毒的ST細(xì)胞X和正常的ST細(xì)胞YFig.3 nocuLated virus ST cells X and normal ST cells Y

2.6 PCR鑒定及測序

提取HLJ-DN病毒基因組，以YVP2、ZVP2為引物，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，在約1 740 bp處有一條特異目的帶，該擴(kuò)增與預(yù)期設(shè)計VP2基因大小相符。將獲得的基因測序，與NCBI發(fā)布的其他25株P(guān)PV VP2基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，該毒株與其他25株毒株的VP2基因存在6處核苷酸位點（Polymorphic site）差異，這些差異堿基散在的分布在整個VP2基因。利用DNAStar對VP2基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（見圖4），HLJ-DN與WB-143株在同一個分支里，同源性高達(dá)99.8%，與親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的WB-773同源性也達(dá)98.8%。

圖4 HLJ-DN VP2基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic analysis of VP2 gene of PPV

3 討論與結(jié)論

豬細(xì)小病毒的各類疫苗使豬繁殖障礙疾病得到一定控制，但近年來又陸續(xù)出現(xiàn)該病報道[11-14]，常與其他病原如豬圓環(huán)病毒、繁殖與呼吸障礙綜合征病毒及藍(lán)耳病等混合感染而致病，不同毒株有不同毒力和臨床表現(xiàn)。對黑龍江省種豬群PPV感染研究，并分離到一株豬細(xì)小病毒，針對該病毒進(jìn)行分子生物學(xué)和免疫學(xué)的鑒定，為下一步研究黑龍江流行毒株與其他流行毒株在基因結(jié)構(gòu)或抗原性上是否有差異提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

豬細(xì)小病毒增殖需要細(xì)胞源性DNA聚合酶用于自我復(fù)制[15]，并需與細(xì)胞同步接種或僅當(dāng)細(xì)胞長至30%～50%單層時接毒。此時細(xì)胞正處在分裂期，大多數(shù)細(xì)胞處在細(xì)胞周期的S期（即DNA合成期），最適合病毒對細(xì)胞的感染，本試驗在病毒分離培養(yǎng)時采用同步接種，接毒量和細(xì)胞密度的比例必須適合，才能達(dá)到大量繁殖病毒和提高病毒滴度目的，需要多次試驗才能摸索出最佳接種比例。朱紹輝等建議將ST細(xì)胞作為增殖PPV首選細(xì)胞[16]，本研究采用ST細(xì)胞對HLJ-DN進(jìn)行分離和傳代，Coackley等發(fā)現(xiàn)[17]，有些胎牛或成年牛血清中含有豬細(xì)小病毒生長抑制因子，含有該血清的細(xì)胞培養(yǎng)液會影響豬細(xì)小病毒的分離，所以在病毒的分離過程中本研究采用有別與其他病毒的接毒和培養(yǎng)方法，即在ST細(xì)胞傳代同時按培養(yǎng)液量的1/10進(jìn)行同步接毒，37℃培養(yǎng)1 h使病毒充分吸附和穿入細(xì)胞之后加入胎牛血清使終濃度至10%，24 h后換為含有較低濃度血清（2%）的DMEM維持液繼續(xù)維持培養(yǎng)，從而減少血清對豬細(xì)小病毒生長的抑制。

在對HLJ-DN分離培養(yǎng)的過程中，本研究采用觀察細(xì)胞病變、血凝試驗及PCR試驗對每代ST細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測。前5代細(xì)胞培養(yǎng)物的監(jiān)測結(jié)果顯示，前5代細(xì)胞培養(yǎng)物沒有明顯的病變，對豚鼠的紅細(xì)胞也沒有血凝作用，但PCR檢測有結(jié)果。第6代接毒細(xì)胞隨培養(yǎng)時間后移先后呈現(xiàn)圓縮、融合、拉網(wǎng)等明顯有規(guī)律的病變，病變細(xì)胞開始崩解脫落，有明顯的細(xì)胞病變，血凝試驗無結(jié)果，PCR檢測有結(jié)果；第12代細(xì)胞培養(yǎng)物對豚鼠紅細(xì)胞開始有血凝作用。這種現(xiàn)象與血凝試驗的敏感性低及細(xì)小病毒形成病毒樣空殼粒子干擾顆粒的特性有關(guān)，或與不同毒株本身的毒力、適應(yīng)性等特性有關(guān)。

本試驗利用血凝試驗、免疫電鏡觀察、免疫熒光檢測等方法對培養(yǎng)的第十二代病毒進(jìn)行鑒定，其中血凝試驗結(jié)果顯示該毒株對豚鼠的紅細(xì)胞有很好的血凝性，說明有病毒存在；免疫熒光試驗結(jié)果顯示該病毒能與豬細(xì)小病毒的特異性抗體發(fā)生結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性；又通過免疫電鏡形象直觀地對該病毒進(jìn)行觀察，從形態(tài)上可明顯看出有實心和空殼兩種病毒粒子，外形特征也與豬細(xì)小病毒相符，對VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增及測序，序列比對正確。對此分離毒株進(jìn)行滴度測定，第十二代病毒的TCID50為10-4.6·mL-1，結(jié)果表明，滴度較高。后續(xù)研究將進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性、免疫原性及病毒的全基因核苷酸序列，以期為豬細(xì)小病毒的流行病學(xué)調(diào)查、診斷及防控提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。

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Isolation and characterization of porcine parvovirous strain HLJ-DN/

LIUXiufen1,2,JIANG Yanping1,TANG Lijie1,LI Yijing1(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Medicine Research Institute of Hubei University of Science and Technology,Xianning Hubei 437100,China)

This research separates a virus from the liver of natural infection pregnant sows stillbirth from a farm in Heilongjiang Province,this virus can grow in the ST cells and lead to an obvious pathological changes in reticuLar cell.According to the Reed Muench method we can calculated the TCID50is 10-4.6·0.1 mL-1;By electron microscope we can observe some virus particles without posterior capsuLe and their diameter is about 20 nm,the virus can agglutinate 0.5%RBC of guinea pig,immunofluorescence test showed a significant fluorescence in the cells,they can react with specific antibody,at the same time we do theVP2 gene amplification and sequencing,we find the sequence alignment is correct.The results show the strain and WB-143 strain are the same branch,up to 99.8%homology.These results illustrated that the separation virus is porcine parvovirus,it named HLJ-DN.

porcine parvovirus;ST cell line;isolation and characterization;VP2 gene

S823

A

1005-9369（2014）06-0074-05

時間 2014-6-11 16:15:07 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140613.0948.001.html

劉秀芬,姜艷平,唐麗杰,等.豬細(xì)小病毒HLJ-DN株分離鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(6):74-78.

Liu Xiufen,Jiang Yanping,Tang Lijie,et al.Isolation and characterization of porcine parvovirous strain HLJ-DN[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):74-78.(in Chinese with English abstract)

2014-01-20

黑龍江省高校創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2011TD001）

劉秀芬（1981-），女，講師，碩士，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail:lxf915@163.com

*通訊作者：李一經(jīng)，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail:yijingli@163.com