產(chǎn)甲酸草酸桿菌細胞數(shù)群體感應系統(tǒng)基因hdtS克隆和功能分析

姜巨全，劉賀男，肖鴻禹，付曉薇，朱光宇

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

產(chǎn)甲酸草酸桿菌細胞數(shù)群體感應系統(tǒng)基因hdtS克隆和功能分析

姜巨全，劉賀男，肖鴻禹，付曉薇，朱光宇

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

為鑒定產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes）是否具有細胞數(shù)群體感應（QS）系統(tǒng)，將費氏弧菌（Vibrio fischeri）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorences）QS系統(tǒng)相關基因與產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）基因組序列進行比對，初步確定hdtS和AGPA為QS系統(tǒng)候選基因。通過PCR和T-A克隆方法分別克隆以上兩個基因并將其構建成表達載體pET19-hdtS和pET19-AGPA，借助SDS-PAGE凝膠電泳證實以上兩個基因均在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中高效表達，采用平板菌株報告法鑒定hdtS具有?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）合成酶的功能，而AGPA則不具有該功能。這是國內(nèi)外首次報道產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中QS系統(tǒng)有關基因，對該菌株QS系統(tǒng)了解及分析影響該菌株在人腸道內(nèi)定殖因素具有重要意義。

克隆；鑒定；產(chǎn)甲酸草酸桿菌；細胞數(shù)群體感應系統(tǒng)；hdtS；AGPA

細胞數(shù)群體感應（Quorum-sensing system,QS）效應是細菌群體行為調(diào)控機制。QS系統(tǒng)作用機制是細菌產(chǎn)生并釋放一種自誘導物（Autoinducer，AI）?；呓z氨酸內(nèi)酯（Acylhomoserine lactone,AHL），當該物質(zhì)積累到一定濃度（閾值）時，可被自身及其他細菌檢測到，誘導細菌中QS相關基因表達[1]。研究表明，細菌通過QS系統(tǒng)可獲得單個菌體本身無法完成的群體性生理功能[2-4]。如雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等腸道益生菌在腸道定殖及與腸道共生作用[2-3]，病原微生物霍亂弧菌（Vibrio cholerae）對機體病原性侵染等[4]。

目前，革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)根據(jù)AHL合成酶及其調(diào)控蛋白可分為3類：LuxI-LuxR系統(tǒng)[1]、LuxM-LuxN/AinS-AinR系統(tǒng)[5-7]和HdtS[8-9]。前兩類系統(tǒng)的研究比較深入詳細，均由AHL合成酶及其調(diào)控蛋白組成；第三類QS系統(tǒng)研究卻非常有限。在熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorences）中，HdtS蛋白能夠產(chǎn)生3-羥基-碳14∶1、碳10∶1或碳6∶1的3種AHL[8]。在專性嗜酸的氧化亞鐵硫桿菌（Acidi?thiobacillus ferrooxidans）中，Act蛋白與熒光假單胞菌中的HdtS有37%同源性，編碼該蛋白的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS及編碼磷酸脂酶的gph形成一個基因簇。這一基因位點在整個變性菌門（Proteobacteria）中具有高度保守性，基因序列一致。Act蛋白被證實編碼合成鏈長為14碳AHL，后者負責調(diào)控氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）中Lux類型QS系統(tǒng)[9]。第三類QS系統(tǒng)僅限于AHL合成酶鑒定，但未發(fā)現(xiàn)與其相關的任何調(diào)控蛋白。

產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes）是一株專性厭氧的革蘭氏陰性菌，以草酸作為唯一碳源和能源。試驗表明，產(chǎn)甲酸草酸桿菌對降低尿中草酸濃度具有重要作用：①可通過降解食物中的草酸，減少血液從腸道食物中吸收的草酸，進而降低尿中草酸濃度[10-11]；②可與腸道黏膜相互作用，使血液中過高的草酸向腸道反向轉運，降低血液中草酸濃度和尿中草酸濃度[12]。臨床調(diào)查顯示，在腎結石患者腸道內(nèi)，產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖率明顯低于其在健康人腸道內(nèi)定殖率[12-13]。產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖與腎結石的再發(fā)率呈顯著負相關[14]。目前影響產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖的因素仍不清楚。只有少數(shù)研究報道，在腎結石患者中，該菌株的喪失與抗生素的過量服用有密切關系[15]。

既然很多腸道細菌的定殖受QS系統(tǒng)控制[2-4]，該系統(tǒng)也可能對產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖同樣起到重要作用。至今尚無任何關于產(chǎn)甲酸草酸桿菌的QS系統(tǒng)的報道。因此，為鑒定該菌QS系統(tǒng)，本研究對QS系統(tǒng)中有關基因進行克隆及功能分析，結果發(fā)現(xiàn)hdtS基因具有AHL合成酶功能。這是國內(nèi)外首次報道產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中QS系統(tǒng)有關基因，對增進對該菌株QS系統(tǒng)了解及分析影響該菌株在人腸道內(nèi)定殖因素具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與載體

產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLS和根瘤菌（Sinorhizobi?um meliloti）Rm1021來自本實驗室；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）由中國農(nóng)業(yè)大學張立群教授提供，該菌株含有一個包括融合基因traI:lacZ和traR的pTiC58質(zhì)粒（慶大霉素抗性）；大腸桿菌（E.coli）DH5α、BL21、Trans-T1感受態(tài)細胞均購自全式金生物公司。原核表達載體pET19-pp-histag（氨芐霉素抗性）由美國維克森林大學W.Todd Lowther教授提供，該載體由提供者在Qiagen公司購買的原核表達載體pET19的組氨酸殘基后，加入一個PreScission Proteinase蛋白酶的酶切位點。

1.1.2 主要儀器

美國Bio-Rad公司Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司PowerPac HC型電泳儀，TC-96/G/H(b)B型PCR儀，寧波新芝生物公司N&DN系列（LCD）型超聲波細胞粉碎機，美國ThermoFisher公司Pico17離心機，上海安亭TGL-16B臺式離心機等。

1.1.3 主要藥品與試劑

氨芐青霉素、慶大霉素購自美國AMRESCO公司；核酸和蛋白Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生物技術有限公司；Nde I、Bam H I均購自Ta?KaRa公司；pEASY-T3 Simple Cloning Kit、Easy Pfu DNA polymerase、T4DNA連接酶均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用5 mmol·L-1NaOH調(diào)pH至7.0。如需配制固體培養(yǎng)基，加入15 g瓊脂。大腸桿菌（E.coli）轉化子在LB平板上37℃培養(yǎng)；根癌農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）NTL4在LB液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、28℃培養(yǎng)24 h。

TY培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物3 g，蛋白胨5 g，CaCl20.6 g，用5 mol·L-1NaOH調(diào)pH至7.0。如需配制固體培養(yǎng)基，加入15 g瓊脂。根瘤菌Sm1021在液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、28℃振蕩培養(yǎng)24 h。

AB培養(yǎng)基：5×A母液（1 L）：（NH4）2SO42 g，Na2HPO49.6 g，KH2PO43 g，NaCl 3 g，用蒸餾水定容至200 mL；1×B母液（1 L）：0.1 mol·L-1CaCl21 mL，1 mol·L-1MgCl21 mL，0.003 mol·L-1FeCl31 mL，用蒸餾水定容至800 mL，分別121℃滅菌30 min備用。配制AB培養(yǎng)基時，將200 mL 5×A與800 mL 1×B混合，并向AB培養(yǎng)基中加入終濃度為0.2%葡萄糖或0.4%醋酸鹽作為碳源。

1.2 方法

1.2.1 QS系統(tǒng)候選基因的全基因組分析

產(chǎn)甲酸草酸桿菌OXCC13（序列號ACDQ 00000000.1）和HOxBLS（序列號ACDP00000000.2）的基因組已經(jīng)被測序完成。在本研究中，借助已知的QS系統(tǒng)模式菌株費氏弧菌(V.fischeri)的luxI/ luxR基因（序列號YP_206882.1/AAQ90196.1）、luxM/luxN基因（序列號BAF43686.1/BAF43687.1）和ainS/ainR基因（序列號YP_204420.1/YP_ 204419.1）以及熒光假單胞菌的hdtS基因（序列號AEV60042.1），與產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組進行比對，獲得QS系統(tǒng)的候選基因。

1.2.2 熱啟動PCR擴增基因

根據(jù)QS系統(tǒng)候選基因序列，使用Primer Pre?mier 5.0設計引物，由華大基因合成，引物序列見表1，其中：CATATG為Nde I酶切位點；GGATCC為Bam H I酶切位點。平末端加A之后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

表1 hdtS與AGPA上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers of genes hdtS and AGPA

1.2.3 T-A克隆載體構建

按照北京全式金生物技術有限公司pEASY-T3 Cloning Kit的說明書進行連接轉化。藍白斑法挑取菌落白色的陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR驗證及雙酶切驗證，基因測序由華大基因公司完成。

1.2.4 表達載體構建

提取質(zhì)粒pET19-pp-histag和T-A克隆的重組質(zhì)粒，分別用Nde I、Bam H I進行雙酶切（100 μL雙酶切體系：10×Buffer 10 μL，質(zhì)粒50 μL，Nde I 2 μL，Bam H I 2 μL，ddH2O 36 μL）。將雙酶切后的pET19-pp-histag及目的基因片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，16℃過夜連接（連接方法按T4DNA連接酶使用說明書操作）。取適量連接體系，轉化大腸桿菌（E.coli）BL21感受態(tài)細胞。操作方法按大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細胞使用說明書操作。

培養(yǎng)后挑取陽性重組子，進行PCR及雙酶切驗證正確后，送華大基因公司測序，最終確定hdtS與AGPA是否融合到表達載體histag的開放閱讀框架（ORF）內(nèi)。

1.2.5 候選基因在大腸桿菌中的誘導表達

分別過夜培養(yǎng)BL21/pET19-HdtS、BL21/pET 19-AGPA，轉接100 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為1.0。各取1 mL上述兩種菌液，離心收集菌體，作為誘導前樣品。向上述兩種培養(yǎng)液中分別添加終濃度1 mol·L-1的IPTG，37℃誘導表達3 h。各取1 mL上述兩種菌液，離心收集菌體，作為誘導后樣品。將上述兩種菌液剩余部分，離心收集菌體，用50 mmol·L-1的PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液清洗兩次，離心，去上清，再取適量緩沖液重懸細胞（保證菌體破壁后蛋白總量與1 mL菌液的蛋白量相同），同時加入終濃度為1 mmol·L-1的PMSF，最后在冰浴中進行超聲波破碎至菌液澄清（超聲波的具體參數(shù)為10%Hz，工作時間20 min，每次超聲1 s，間隔時間1.5 s）。取破碎液，離心，收集上清及沉淀。上清作為可溶性蛋白樣品，沉淀用等體積的緩沖液重懸，作為不可溶性蛋白樣品。以上所有樣品進行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測。

1.2.6 AHL合成酶的平板菌株報告法

分別將根癌農(nóng)桿菌NTL4、根瘤菌Rm1021、BL21/pET19-HdtS、BL21/pET19-AGPA和BL21/ pET19-pp-histag分別接入AB基本培養(yǎng)基（X-gal終濃度為40 μg·mL-1）中，28℃恒溫培養(yǎng)后觀察菌落周圍顏色是否變藍。

2 結果與分析

2.1 QS系統(tǒng)候選基因的確定

如表2所示，在兩株產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組中，沒有任何序列與ainS/ainR基因具有同源性；而一些序列分別與luxI/luxR基因、luxM/luxN基因具有非常低的同源性（4.6%～15.8%）；然而，一個編碼推測的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉移酶（Puta?tive 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase）的基因（在HOxBLS中的序列號為OFAG_01224）與熒光假單胞菌的hdtS具有高度同源性（分別為36.0%和36.7%）。

研究發(fā)現(xiàn)，該基因不僅與熒光假單胞菌的hdtS高度同源，而且與目前被鑒定的氧化亞鐵硫桿菌中的編碼HdtS型AHL合成酶的act基因也高度同源（見圖1）。此外，產(chǎn)甲酸草酸桿菌中hdtS基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS以及編碼磷酸脂酶的gph形成一個基因簇（見圖2），這與氧化亞鐵硫桿菌中的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS及編碼磷酸脂酶gph形成的基因簇的基因順序也高度一致。因此，推測編碼1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉移酶的基因很可能就是產(chǎn)甲酸草酸桿菌中編碼HdtS類的QS系統(tǒng)候選基因，定名為hdtS。

表2 產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLs及OXCC13的群體感應系統(tǒng)基因組學分析Table 2 Genomic analyses for quorum sensing systems ofOxalobacter formigenesHOxBLS and OXCC13

圖1 hdtS和AGPA的推測氨基酸序列及其與同源物的同源性比對Fig.1 Deduced amino acid sequences of hdtS and AGPA,together with alignment between them and their homologs

圖2 HOxBLS的hdtS基因及其上下游序列形成的基因簇結構Fig.2 Mapping of hdtS and its upstream and downstream sequences from O.formigenes HOxBLS

在基因組分析過程中，還意外發(fā)現(xiàn)另一個基因（序列號OFAG_01272）也被推測為編碼1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉移酶，該基因編碼蛋白與熒光假單胞菌hdtS蛋白（41.7%）、氧化亞鐵硫桿菌中Act蛋白（36.7%）及上述HdtS蛋白（19.7%）均具有一定同源性（見圖1C）。選擇AGPA作為另一個AHL合成酶的候選基因，將其定名為AGPA（putative 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase）?；騢dtS和AGPA的核苷酸序列和推測蛋白序列如圖1A、B。

2.2 QS系統(tǒng)候選基因克隆載體和表達載體的構建

以產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLS基因組DNA為模板，使用PCR分別擴增hdtS與AGPA基因，并通過T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體上，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞得到陽性克隆，經(jīng)測序驗證二者均與原序列一致。為驗證這兩個基因是否具有AHL合成酶功能，將hdtS與AGPA構建到表達載體pET19-pp-histag中，轉化大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR擴增、雙酶切及測序驗證，hdtS與AGPA均成功融合到表達載體histag的開放閱讀框架（ORF）內(nèi)。轉入表達載體大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3），分別命名為BL21/pET19-hdtS和BL21/pET19-AGPA。

2.3 pET19-hdtS及pET19-AGPA在大腸桿菌中的誘導表達

為鑒定hdtS與AGPA是否表達，分別對BL21/ pET19-hdtS與BL21/pET19-AGPA進行IPTG誘導，并在誘導前后取樣，將樣品與相應細胞破碎后的上清和沉淀樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。如圖3所示，BL21/pET19-hdtS與BL21/pET19-AGPA在35 ku附近均出現(xiàn)一條明顯的粗帶，與預測hdtS或AGPA蛋白分子質(zhì)量（34 ku）接近，表明hdtS與AG?PA基因在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中被高效誘導表達。此外，在BL21/pET19-hdtS或BL21/ pET19-AGPA細胞破碎后的上清液中也出現(xiàn)同樣大小且濃度相近的粗帶（見圖3），表明誘導表達的hdtS或AGPA蛋白大部分可溶，說明在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中異源表達后，hdtS或AGPA蛋白應該正確折疊且具有活性。

圖3 hdtS與AGPA在大腸桿菌中的誘導表達及蛋白可溶性分析Fig.3 Expression and solubility analysis of hdtS and AGPA in E.coli BL21

2.4 hdtS及AGPA的功能分析

使用平板菌株報告法，驗證BL21/pET19-hdtS及BL21/pET19-AGPA是否具有AHL合成酶功能。報告菌株根癌農(nóng)桿菌NTL4含1個包括融合基因traI：lacZ和traR的pTiC58質(zhì)粒，如果受測試菌株產(chǎn)生AHL，而AHL又可以由胞內(nèi)向胞外分泌，這樣就可以通過AHL誘導該質(zhì)粒lacZ的表達，從而降解X-gal而使平板上的菌落周圍產(chǎn)生藍色圓圈。根瘤菌Rm1021自身可以產(chǎn)生AHL，故被用作正對照檢測試驗體系正確與否。如圖4中所示，在根瘤菌（Rm1021周圍產(chǎn)生藍色菌圈，說明試驗體系正確。BL21/pET19-pp-histag和BL21/pET19-AGPA周圍并沒有產(chǎn)生藍色菌圈，而BL21/pET19-hdtS周圍卻產(chǎn)生明顯的藍色菌圈。由此可以證明hdtS蛋白確實具有AHL合成酶功能，而AGPA蛋白并不具有該功能。

圖4 平板菌株報告法檢測AHL合成酶活性Fig.4 Identification of an AHL synthase using a reporter strain Agrobacterium tumefaciens NTL4

3 討論與結論

至今為止，沒有任何產(chǎn)甲酸草酸桿菌的QS系統(tǒng)有關基因報道。本研究首次克隆該菌hdtS類的QS系統(tǒng)基因并對基因功能進行鑒定。借助生物信息學方法，將已知的QS系統(tǒng)基因與產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)HOxBLS中存在一個編碼推測的1-?；?sn-甘油-3-磷酸轉移酶的基因與hdtS基因高度同源，通過對該基因的克隆與功能分析，最終確定該基因是產(chǎn)甲酸草酸桿菌中hdtS類的QS系統(tǒng)基因。

目前普遍使用AHL檢測方法是生物學方法，即平板菌株報告法[2-4]。本研究中，根癌農(nóng)桿菌NTL4作為報告菌株，在一定濃度X-gal存在的平板上，能快速、且直觀地檢測到菌落周圍是否顯示藍色，從而證明所克隆基因是否編碼AHL[2-4]。通過驗證，發(fā)現(xiàn)HdtS蛋白確實具有AHL合成酶功能。在對hdtS基因鑒定的過程中，發(fā)現(xiàn)AGPA與前者具有一定同源性，但通過功能分析，確定后者不具有AHL合成酶功能。

對細菌中AHL進行選擇性定量檢測方法為氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法。該方法可評估不同生長階段AHL產(chǎn)生模式[6]，對檢測表達多種獨立信號系統(tǒng)細菌培養(yǎng)物中的AHL在量上變化更為有效[7-8]，可進一步研究確定其生物合成途徑及AHL獨特細胞交流功能[1-2,9]，在對群體感應系統(tǒng)信號分子研究中應用廣泛[1-2]。在平板菌株報告法結論基礎上，后續(xù)研究將對BL21/pET19-hdtS細菌培養(yǎng)提取物進行GC-MS檢測，進一步證明其具有AHL合成酶功能，確定HdtS具體合成AHL種類和不同生長階段AHL變化動態(tài)。

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Cloning and identification ofhdtSgene fromOxalobacter formigenes encoding an acylhomoserine lactone synthase of quorum-sensingsystem/

JIANG Juquan,LIU Henan,XIAO Hongyu,FU Xiaowei,ZHU Guangyu（School of Life Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

To identify the quorum-sensing system(QS)genes inOxalobacter formigenes,QS-related genes fromVibrio fischeriandPseudomonas fluorenceswere aligned with the genome sequence ofO. formigenes.The geneshdtSandAGPAwere chosen as the candidate QS-related genes,cloned by PCR into the vector pEASY-T3,and constructed into pET19-pp-histag.The resulting expression vectors designated pET19-hdtS and pET19-AGPA were transformed intoEscherichia coliBL21(DE3),respectively, followed by the induction by IPTG.SDS-PAGE showed that the genes hdtS and AGPA were over-expressed inE.coliBL21(DE3).ThehdtSgene,butAGPAnot,was finally established to encode an acylhomoserine lactone(AHL)synthaseviaan AHL reporter strain,Agrobacterium tumefaciensNTIA(pZLR4)through the double-agar diffusion method.To the best of our knowledge,this is the first report on the cloning andidentification of the QS-realted gene fromO.formigenes,which is very helpful for better understanding of the quorum sensing system ofO.formigenesand analysis of impact factors of its colonization in human intestines.

cloning;identification;Oxalobacter formigenes;quorum-sensing system;hdtS;AGPA

Q933；Q751

A

1005-9369（2014）06-0049-08

時間 2014-6-11 16:17:57 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1617.017.html

姜巨全,劉賀男,肖鴻禹,等.產(chǎn)甲酸草酸桿菌細胞數(shù)群體感應系統(tǒng)基因hdtS克隆和功能分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45 (6):49-56.

Jiang Juquan,Liu Henan,Xiao Hongyu,et al.Cloning and identification ofhdtSgene fromOxalobacter formigenesencoding an acylhomoserine lactone synthase of quorum-sensing system[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45 (6):49-56.(in Chinese with English abstract)

2014-04-02

黑龍江省自然科學基金留學項目（LC201025）；教育部留學回國人員基金項目（2012940）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項目（2012RFLXN004）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為分子微生物學與生物技術制藥。E-mail：jjqdainty@163.com.