廣西百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB的突變特征分析①

韋紅玉，隆昕穎，凌俊，趙麗娟②，謝振鋒，唐華英，韋連登，陳源紅，覃艷春

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 百色 533000

E-mail：why-825＠163.com；2.廣西百色市疾病預(yù)防控制中心，廣西 百色 533000；3.廣西百色市婦幼保健院，廣西 百色 533000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病，我國仍是22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。近年來，我國每年報告肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)約100萬，導(dǎo)致結(jié)核病高發(fā)病率和死亡率的重要因素之一是耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生，耐藥肺結(jié)核有以下4種類型，單耐藥（monoresistance）：僅對1種抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥（polyresistance）：對1 種以上的抗結(jié)核藥物耐藥（不包括同時對異煙肼和利福平耐藥的情況）；耐多藥（Multidrug resistance，MDR）：至少對異煙肼和利福平同時耐藥；廣泛耐藥（Extensively drug-resistant，XDR）：除對異煙肼和利福平耐藥之外，同時對任意1種氟喹諾酮類藥物及對3種二線抗結(jié)核藥物注射劑（卡那霉素、丁胺卡那霉素和卷曲霉素）中的至少1種耐藥［1］。目前耐藥肺結(jié)核危害日益凸顯，每年新發(fā)患者人數(shù)約12萬，未來數(shù)年內(nèi)可能出現(xiàn)以耐藥菌為主的態(tài)勢。因此耐藥結(jié)核病一直都是臨床治療的難點和基礎(chǔ)研究的熱點［2］。近年來世界各地結(jié)核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。利福平是傳統(tǒng)的抗結(jié)核一線藥物，結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥機制可能是，編碼RNA 聚合酶beta亞基的rpoB 基因的突變使利福平不能與之結(jié)合，從而產(chǎn)生對利福平的耐藥［3］。目前很多預(yù)測利福平耐藥的分子檢測方法已經(jīng)建立起來［4-5］，以往研究［6-9］顯示單耐利福平菌株的rpoB基因突變多分布在“利福平耐藥決定區(qū)”（rifampin resistance determining region，RRDR），507-533 位 密 碼 子，共81 bp。

本研究擬了解百色地區(qū)耐利福平結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpoB基因RRDR 突變特征及其與耐藥的關(guān)系。為本地區(qū)耐藥結(jié)核的防治和制訂有效的預(yù)防及干預(yù)耐藥結(jié)核病措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年在百色市疾病控制中心結(jié)核病防治所就診的結(jié)核病痰液涂片陽性128例患者（包括百色市及百色地區(qū)各縣新發(fā)和復(fù)發(fā)患者，年齡19～88歲；男96例，女32例）的痰標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及耐藥性檢測 痰液涂片陽性細(xì)菌采用改良的羅氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的菌株采用絕對濃度法進(jìn)行耐藥性檢測。

1.2.2 基因組DNA 提取和rpoB基因RRDR 的PCR 擴增和測序 基因組DNA 采用北京andybio公司生產(chǎn)的分枝桿菌DNA 提取試劑盒（柱式）提取，rpoB基因擴增引物為rpoB-F：5′-TACGGTCGGCGAGCTGATCC-3′，rpoB-R ：5′-TACGGCGTTTCGATGAACC-3′［10］（引 物 由 華 大 基 因 公 司合成），序列大小為411bp。PCR 擴增采用50μl反應(yīng)體系：5 μl模板，上下游引物各1.5μl，ddH2O 17μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 25μl（購自北京全式金生物公司）。擴增程序為：95℃變性5min；94℃變性1min，58.5℃退火1min，72℃延伸1 min；循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA 序列測定與分析 PCR 產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。用BLAST 與H37RV 菌株相應(yīng)基因進(jìn)行序列比對，通過DNAman軟件判斷突變基因突變位點及形式。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 從128例痰液涂片陽性標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得98例MTB菌株，36株對利福平耐藥。

2.2 PCR 檢測結(jié)果 提取耐藥菌株DNA 進(jìn)行PCR，PCR 擴增產(chǎn)物與目的片段大小一致，部分PCR 產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。2.3 測序比對結(jié)果 36株耐藥菌株中，27株在rpoB“RRDR”區(qū)域出現(xiàn)突變，突變位點有4個，rpoB 單個突變位點突變特征，見表1。

圖1 耐藥菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳圖

表1 rpoB突變位點突變特征

3 討論

耐利福平MTB rpoB 基因突變主要發(fā)生在“RRDR”，以531、526、516位突變最為多見。已有文獻(xiàn)報道我國北京市等8個地區(qū)MTB rpoB基因突變情況［11-12］，而百色地區(qū)尚未見類似報道。本研究檢測結(jié)核病患者痰標(biāo)本rpoB基因RRDR 突變及其性質(zhì)，為在我地區(qū)建立快速檢測耐利福平結(jié)核病基因診斷技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

本實驗98 例 MTB 出現(xiàn)36 株利福平耐藥，耐藥率為36.73%，檢測耐藥菌rpoB基因序列，36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因發(fā)生突變，基因突變率為75.00%，與貴州省遵義 地 區(qū)rpoB 基 因 突 變 率 相 似［11］，其 中516 位 點 突 變 率為3.70%（1／27），531 位 點 突 變 率 為59.26%（16／27），526 位點突變率為29.63%（8／27），533位點突變率為7.41%（2／27）。與常規(guī)藥敏實驗相符。531位點突變率與東部地區(qū)rpoB531突變頻率（61.2%）［13］及中部地區(qū)rpoB531突變頻率（58%）［14］研究結(jié)果相近，該研究中較高的rpoB531 突變頻率也可能是由于耐藥菌株對于rpoB531的選擇壓力造成的［15］。有報道，531位和526位是最常見的突變位點，且531多于526［16］，與本地區(qū)的rpoB基因突變結(jié)果一致，但也有報道，526位突變頻率高于531位突變頻率［3，17］，另本實驗未出現(xiàn)已報道的522、550、511、513突變位點，說明rpoB基因突變位點在我國有一定的地域差異。本實驗說明百色地區(qū)耐利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生主要是因為rpoB 的531 位點密碼子發(fā)生改變，其次是526位點密碼子發(fā)生改變，與蘇州市、廣東省、河南省等地突變特征相似［10，18-19］，進(jìn)一步闡明利福平耐藥機制主要與基因突變有關(guān)，特別是與531位點突變相關(guān)。9株未發(fā)生突變與常規(guī)藥敏實驗不符，說明利福平耐藥性的產(chǎn)生可能還有其它耐藥機制或常規(guī)藥敏實驗也有誤差，或是患者對MTB發(fā)揮免疫防御過程中患者自身遺傳易感性及免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的打破使機體不能清除MTB而導(dǎo)致耐藥［20］。

總之，本研究首次采用DNA 序列測定技術(shù)分析百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平rpoB 基因的突變特征，為開發(fā)結(jié)核分枝桿菌耐藥性分子檢測方法和闡明MTB利福平耐藥機制積累了實驗數(shù)據(jù)。

［1］ World Health Organization.Extensively drug-resistant tuberculosis（XDR-TB）：recommendations for prevention and control［J］.Wkly Epidemiol Rec，2006，81（45）：430-432.

［2］ 崔振玲.廣泛耐藥結(jié)核病現(xiàn)狀及研究進(jìn)展［C］.首屆中國臨床微生物學(xué)大會（寧波會議）暨《醫(yī)學(xué)參考報》微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文集，2010：219-223.

［3］ 肖和平，唐神結(jié).耐藥結(jié)核病防治手冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

［4］ Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance［J］.N Engl J Med，2010，363（11）：1005.

［5］ Helb D，Jones M，Story E，et al.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand，near-patient technology［J］.J Clin Microbiol，2010，48（1）：229.

［6］ Zhang Y，Yew WW.Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（11）：1320.

［7］ Riska PF，Jacobs WR Jr，Alland D.Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2000，4（2）：S4.

［8］ Ramaswamy S，Musser JM.Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis：1998update［J］.Tuber Lung Dis，1998，79（1）：3.

［9］ Miller LP，Crawford JT，Shinnick TM.The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38（4）：805.

［10］ 許蘊怡，譚耀駒，曾少芳，等.廣東地區(qū)臨床分離結(jié)核分枝桿菌KatG、rpoB、rpsL 耐藥基因變異研究［J］.中國處方藥，2012，10（3）：41-44.

［11］ 甘辛，陳玲，王建華，等.結(jié)核分枝桿菌耐利福平rpoB基因突變的序列分析［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30（3）：268-271.

［12］ 包洪，于庭，印璞，等.中國部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平、異煙肼和鏈霉素耐藥基因的檢測［J］.中國實驗診斷學(xué)，2007，11（2）：232-234.

［13］ Luo T，Zhao M，Li X，et al.Selection of mutations to detect multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Shanghai，China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：1075.

［14］ Zhang SL，Qi H，Qiu DL，et al.Genotypic analysis of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from central China［J］.Biochem Genet，2007，45（3／4）：281.

［15］ Gagneux S，Long CD，Small PM，et al.The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］.Science，2006，312（5782）：1944.

［16］ Wu Xueqiong，Zhang Junxian，Chao Lixue，et al.Identification of rifampin-resistant genotypes in Mycobacterium tuberculosis by PCR-reverse dot blot hybridization［J］.Mol Biotechnol，2009，41（1）：1-7.

［17］ Pozzi G，Meloni M，Iona E，et al.rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy［J］.J Clin Microbiol，1999，37（4）：1197.

［18］ 張建平，沈興華，王霞芳，等.蘇州市耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因突變特點的研究［J］.中華疾病控制雜志2012，16（4）：293-296.

［19］ 趙玉玲，楊洪毅，馬曉光，等.河南省耐多藥結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB 的突變特征［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，47（2）：166-169.

［20］ 秦歡，羅軍敏.結(jié)核分枝桿菌耐藥機制研究新進(jìn)展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2013，8（8）：759-761.