利用組織芯片技術(shù)研究CDX2和MUC2在萎縮性胃炎及胃癌組織中的表達①

陳淑敏，鄒宗楷，唐忠輝，沈洪武，蘇海燕，陳雅靜，林彩環(huán)

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院病理學教研室，福建 漳州 363000 E-mail：chensm1705＠163.com；2.福建省漳州市醫(yī)院病理科，福建 漳州 363000）

胃癌是我國最常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄 因 子2（caudal type homeobox transcription factor-2，CDX2），屬腸特異性轉(zhuǎn)錄因子，對腸上皮細胞的分化、凋亡和腸道特定基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。黏蛋白2（mucin 2，MUC2）是MUC2基因編碼的一種分泌性黏蛋白，主要功能是在腸腔的上皮表面形成保護屏障?？茖W研究發(fā)現(xiàn)CDX2和MUC2在胃黏膜腸化生及胃癌組織中表達異常［1］。本實驗采用組織芯片技術(shù)構(gòu)建101例組織芯片，用免疫組化方法（S-P 法）檢測組織芯片中CDX2和MUC2的表達，旨在探討他們的表達與萎縮性胃炎及胃癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取漳州市醫(yī)院病理科2002年7月～2003年1月期間隨訪資料完整的41例原發(fā)性胃癌手術(shù)切除標本的蠟塊及30例萎縮性胃炎標本蠟塊。另胃鏡活檢選取30例正常胃黏膜作為對照。復習全部病例的臨床資料，胃癌病例按新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范進行組織分型、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分站及TNM 分期。其中乳頭狀腺癌6例、管狀腺癌17例、低分化腺癌6例、黏液腺癌7例、印戒細胞癌1例。所有患者術(shù)前未經(jīng)過任何抗癌治療。

1.2 主要試劑 實驗用兔抗人CDX2 單克隆抗體（克隆號：EPR2764Y，即用型，產(chǎn)品編號：RMA-0631）、鼠抗人MUC2單克隆抗體（克隆號：M53，即用型，產(chǎn)品編號：MAB-0075）及SP免疫組化試盒及DAB顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 組織芯片制作 步驟一：HE 染色切片形態(tài)學觀察，確定目標組織：萎縮性胃炎的胃黏膜、胃癌等。步驟二：選擇目標組織并分別在組織切片和相應(yīng)石蠟組織上標記。步驟三：依次制作取材針、組織芯片制孔器和7×5和7×6點列陣的組織芯片受體模塊［2］；用取材針從已定位的石蠟上取目標組織到組織芯片受體蠟塊的相應(yīng)孔內(nèi)，構(gòu)建含有正常胃黏膜、萎縮性胃炎及胃癌的組織陣列蠟塊。步驟四：將組織陣列蠟塊行連續(xù)切片，切片厚度為4μm，與常規(guī)組織制片操作基本相似。

1.4 免疫組化 采用S-P方法對組織芯片切片進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復染，封片，具體操作按照SP 試劑盒說明書進行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用腸黏膜組織切片作陽性對照。

1.5 染色結(jié)果判斷 染色結(jié)果采用半定量分析法：以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分。CDX2蛋白表達陽性為胞核出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。MUC2蛋白表達陽性為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性（染色深淺需與背景著色相對比）計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即某類細胞5個視野（每400×高倍視野計數(shù)100個此類細胞）的陽性細胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。每張切片隨機取5個400倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分。采用雙盲法，分別由兩位資深病理醫(yī)師觀察計分，取二者的平均評分作為每張切片的染色強度分值和陽性細胞百分比計分。最終評分為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（＋），5～8分為中度陽性（＋＋），9～12分為強陽性（＋＋＋）。1～12分在文中都描述為陽性。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行分析，陽性率以%表示。采用行×列表χ2檢驗，Spearman 秩相關(guān)檢驗。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片的質(zhì)量 構(gòu)建含30例正常胃黏膜、30例萎縮性胃炎和41例胃癌患者的組織芯片，30例萎縮性胃炎和41例胃癌患者的組織芯片。蠟塊組織陣列排列整齊，常規(guī)切片組織形態(tài)良好。在101例組織芯片中有7例發(fā)生取材定位不準、掉片和皺折現(xiàn)象，其中胃癌4 例、正常胃黏膜2 例、萎縮性胃炎1例。41例胃癌中只有1例印戒細胞癌，故剔除掉?？偣?例芯片在結(jié)果分析時未納入統(tǒng)計。

2.2 CDX2和MUC2在正常胃黏膜、萎縮性胃炎和胃癌組織中的表達情況 在正常情況下，CDX2表達于腸黏膜上皮細胞的胞核，染色呈棕黃色。MUC2主要表達于腸道的杯狀細胞的胞質(zhì)中，染色呈棕黃色。本實驗發(fā)現(xiàn)在正常胃黏膜中CDX2、MUC2無表達（見圖1A 和圖1B）。在29例萎縮性胃炎組織中CDX2全部表達陽性（100%），MUC2表達陽性21例（72.41%）（見圖2A 和圖2B）。在胃癌組織中CDX2陽性染色主要定位于細胞核，其陽性表達率為66.67%（見圖3A）。在胃癌組織中MUC2主要定位于胞質(zhì)，其陽性表達率為13.89%（見圖3B）。CDX2、MUC2在不同胃黏膜陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 CDX2和MUC2在不同胃黏膜病變中的表達

圖1A 正常胃黏膜CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

圖1B 正常胃黏膜MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

圖2A 萎縮性胃炎伴腸化生CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

圖2B 萎縮性胃炎伴腸化生MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

圖3A 胃癌黏膜CDX2免疫組化結(jié)果（S-P法×400）

圖3B 胃癌黏膜MUC2免疫組化結(jié)果（S-P法×200）

2.3 CDX2和MUC2蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 通過統(tǒng)計學分析表明，CDX2在男女性別表達差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。CDX2 表 達 在 低 分 化 腺 癌 陽 性 率 最高（83.33%），在管狀腺癌陽性率最低（58.82%），但差異無統(tǒng)計學意義。CDX2在高中分化程度組的陽性表達率為55%，低分化程度組陽性表達率為81.25%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MUC2在低分化腺癌陽性表達率為33.33%，黏液腺癌陽性表達率為42.86%，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。在高中分化程度組的陽性表達率為0，低分化程度組陽性率31.25%，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。CDX2和MUC2在胃癌組織中的表達與病人年齡、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均無關(guān)（P ＞0.05）。以上結(jié)果見表2。

2.4 CDX2和MUC2蛋白表達的相關(guān)性 在萎縮性胃炎黏膜中CDX2表達陽性率為100%，MUC2表達陽性率為72.40%，二者無明顯相關(guān)性。在胃癌組織中MUC2陽性表達的病例都發(fā)生在CDX2陽性表達的病例中，但二者無明顯相關(guān)性（r ＝0.284，P ＝0.093），以上結(jié)果見表3。

2.5 CDX2和MUC2蛋白共同表達與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CDX2和MUC2表達陽性者共5例，全部累及肌層甚至達漿膜層，全部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。CDX2（＋）／MUC2（-）者共19例，累及肌層甚至達漿膜層13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有18例，10例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。CDX2（-）／MUC2（-）者共12例，累及肌層甚至達漿膜層9例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有11例，8例TNM 分期為Ⅲ期或Ⅳ期。以上結(jié)果見表4。

3 討論

本實驗采用組織芯片技術(shù)，具有高通量的優(yōu)點，提高實驗效率；使實驗對照平行化，減少實驗誤差。實驗中使用自制的組織芯片制孔器制作受體蠟塊，一次制孔完成，省時省力，減少了實驗費用。

本實驗發(fā)現(xiàn)CDX2在不同胃黏膜陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.001）。CDX2在正常胃黏膜上皮中不表達，在萎縮性胃炎中全部表達陽性（100%），與文獻結(jié)果相似［3］，可能與所選取病例都是萎縮性胃炎伴腸上皮化生有關(guān)。切片觀察發(fā)現(xiàn)陽性表達都發(fā)生于腸化生的杯狀細胞，提示CDX2的表達是發(fā)生胃黏膜腸化生的重要起始事件，而萎縮性胃炎伴腸上皮化生是胃癌的癌前病變。正常胃黏膜上皮沒有CDX2表達，但胃癌中卻有較高表達，并與分化程度無關(guān)，提示CDX2可能具有區(qū)分非腫瘤性和腫瘤性胃黏膜上皮的潛能。在胃癌黏膜組織中CDX2的表達低于萎縮性胃炎，考慮CDX2基因的突變可能導致CDX2表達缺失，最終導致胃癌的發(fā)生［4］。另外，本實驗結(jié)果與朱惠君等［5］相似，發(fā)現(xiàn)CDX2 異常表達與組織學分型、年齡、臨床病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素無關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)CDX2的陽性表達有男女差別，且差異有統(tǒng)計學意義，考慮：①本實驗的病例數(shù)較少，應(yīng)增加標本數(shù)減少偏差；②CDX2表達確實與性別有關(guān)，是否與不同性別基因易感性不同有關(guān)，具體機制需要進一步探討。

表2 CDX2和MUC2的表達及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 胃癌組織CDX2和MUC2表達的相關(guān)性

表4 胃癌CDX2、MUC2共同表達與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系 （n，%）

本實驗發(fā)現(xiàn)MUC2在不同胃黏膜陽性表達率差異有統(tǒng)計學意 義（P ＜0.001）。MUC2 蛋 白 表 達 于 萎 縮 性 胃炎（72.41%），可能與MUC2蛋白在上皮更新分化方面具有重要作用有關(guān)。胃癌中黏液腺癌和低分化腺癌MUC2陽性率高，與陳亞男等［6］、南則仲等［7］研究結(jié)果相似，認為MUC2可作為研究黏液腺癌的較好指標。MUC2的表達與分化程度有關(guān)，主要表達于低分化程度組。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC2在胃癌組織中的表達與浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均無關(guān)，考慮腫瘤的遷移與擴散可能是多因素綜合作用的結(jié)果，可能與Survivin、CD147和CD34 等異常表達有關(guān)［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)不論在萎縮性胃炎或胃癌組織中CDX2 和MUC2的表達無明顯相關(guān)性，與文獻報道不一致［9-10］。Yamamoto等［11］認為CDX2蛋白可能通過作用于MUC2基因的啟動子，上調(diào)MUC2 mRNA 的活性，共同參與胃黏膜腸化。本研究認為CDX2的表達可影響MUC2的表達，但還有其他因素共同調(diào)控和決定MUC2 的表達，具體機制需進一步深入研究。

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