壯醫(yī)藥線點灸聯(lián)合針挑療法對大鼠坐骨神經(jīng)痛相關(guān)神經(jīng)元和遞質(zhì)的影響①

李克明，唐漢慶，黃岑漢，鄭建宇，李曉華，竇錫彬，黃春傳，趙玉峰，趙秋華

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

坐骨神經(jīng)痛（sciatica）屬于神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP），是一種慢性反復(fù)性疼痛。臨床上坐骨神經(jīng)痛患者病程較長，少則數(shù)個月，多則十余年，給患者帶來長期痛苦，給家庭和社會帶來沉重的醫(yī)療費用負(fù)擔(dān)，尋找費用低廉、效驗明確的治療方式方法值得研究。民族醫(yī)藥中，壯醫(yī)藥線點灸療法和針挑療法廣泛應(yīng)用于一些慢性疼痛、疑難病的治療中，療效確切，已被臨床實踐證明［1-2］，而對于其治療坐骨神經(jīng)痛的機制研究較少。最近的研究［3］表明γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元的氧化損傷是坐骨神經(jīng)痛發(fā)生的重要病理機制，我們在以往實驗工作中觀察到壯醫(yī)藥線點灸聯(lián)合針挑療法能夠增強D-半乳糖所致衰老模型大鼠抗氧化酶活性、提高其抗氧化能力，在此基礎(chǔ)上，我們建立坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）大鼠模型，通過壯醫(yī)藥線點灸聯(lián)合針挑療法的干預(yù)，檢測抗氧化／氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）的活性或水平，同時觀察GABA A 受體（GABAAR）mRNA 表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)GABA 和5-羥色胺（5-HT）含量以及GABA 能神經(jīng)元的凋亡變化，從GABA 能神經(jīng)元氧化損傷的角度初步探討壯醫(yī)藥線點灸聯(lián)合針挑療法治療坐骨神經(jīng)痛的機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD 大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（185.25±6.36）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2013-0006。動物在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫控制在（23±1）℃范圍內(nèi)，相對濕度60%～70%，大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水。對動物的使用和處理遵循2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》有關(guān)條款。

1.2 主要試劑和儀器 SOD（批號20130612）、GSH-Px（批號20130405）、MDA（批號201302065）、ROS（批號201306009）檢測試劑盒（均由武漢博士德公司提供）；GABA 檢測試劑盒（批號0313635，北京博惠嘉業(yè)生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)）；5-HT 檢測試劑盒（批號02130612，上海生物化學(xué)公司生產(chǎn)）；水合氯醛（批號20130013，北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)）；Trizol（Gibcobrl公司）；M-MLV（Piomegan公司生產(chǎn)）；Tag酶、DNAmark（北京博奧公司生產(chǎn)）；GABAAR 基因引物（Invitrogen公司生產(chǎn)）；鼠抗GABA 多克隆抗體、二抗兔抗鼠及Tunel凋亡檢測試劑盒（美國R＆D 公司生產(chǎn)）。

電子天平（AE160型，瑞士Mettler公司生產(chǎn)）；電動玻璃勻漿機（DY-89 型，寧波新芝公司生產(chǎn)）；超聲波細(xì)胞破碎機（SONICS型，U.S.A 生 產(chǎn)）；高 速 低 溫 離 心 機（PK121R 型，ALC 公司生產(chǎn)）；超低溫冰箱（MDF-U72V 型，日本三洋公司生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀（MK3 型，Thermo Labsystem 公 司 生 產(chǎn)）；凝 膠成像系統(tǒng)（chemidoc XRS型，美國伯樂生產(chǎn)）；PCR 儀（7900HT型，ABI公司生產(chǎn)）；紫外分光光度儀（DU530型，Beckman公司生產(chǎn)）；倒置式生物顯微鏡（DMIL LED，德國萊卡生產(chǎn)）。

2 方法

2.1 動物分組和造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組（簡稱對照組）、假手術(shù)組、模型組、藥線＋針挑組（簡稱聯(lián)合組），每組20只。模型組、聯(lián)合組參考文獻(xiàn)［4］的改良方法進(jìn)行CCI造模，造模方法：10% 水合氯醛按3 mL／kg 腹腔注射麻醉，手術(shù)部位均選取左側(cè)，常規(guī)消毒，沿大鼠左股后外側(cè)縱行切開皮膚大約2cm 長，用止血鉗子鈍性分離大鼠半腱肌及股二頭肌，在肌間縫隙中游離出坐骨神經(jīng)，并使之充分暴露，多孔膠片包裹結(jié)扎部位的神經(jīng)，然后再用6.0的手術(shù)縫合線做四道結(jié)扎，間距約1mm，結(jié)扎的松緊度以不影響神經(jīng)外膜的血運為度，關(guān)閉切口，縫合皮膚前后分別消毒1次。

假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎坐骨神經(jīng)，其余步驟和模型組、聯(lián)合組的操作相同。對照組不作任何操作。

聯(lián)合組在造模組造模成功基礎(chǔ)上，采用壯醫(yī)藥線點灸聯(lián)合針挑療法進(jìn)行干預(yù)，具體如下：根據(jù)李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》取雙側(cè)足三里穴位（ST36），拇指和食指手持中號壯醫(yī)藥線（藥線直徑為0.7mm）在酒精燈或蠟燭上點燃后，熄滅藥線明火火焰，此時藥線剩下圓珠狀炭火星，順應(yīng)手腕和拇指的屈曲動作，拇指指腹穩(wěn)重而敏捷地將有圓珠狀炭火星線頭直接點壓于足三里穴位上，火滅即起稱為1壯，每穴每次共灸3壯。每天每穴點灸1次。7d為1個療程，間隔1d繼續(xù)下個療程。同時，取左側(cè)陽陵泉（GB34）、環(huán)跳（GB30）穴位。操作：穴位皮膚常規(guī)消毒，采用消毒大號縫衣針將上述穴位作為針挑點，用拇指、食指、中指合攏把針握緊，挑出皮下一些白色纖維組織，然后用針在該穴位垂直快速點刺3次，刺入皮下1mm，點刺后以5%碘酒、75%酒精消毒，每天每穴位挑刺1次。7d為1個療程，間隔1d繼續(xù)下個療程。聯(lián)合組進(jìn)行連續(xù)3個療程的處理。對照組、假手術(shù)組和模型組不作特殊處理。

2.2 大鼠行為學(xué)觀察 造模后，觀察大鼠自主行為，如有否跛行、自噬行為，反應(yīng)是否敏捷及活動度、攝食行為等。

2.3 指標(biāo)檢測 療程結(jié)束后，處死大鼠。取靜脈血2ml，離心（4 ℃，1 000r／min，10min），分離血清，-70 ℃凍存。采用比色法測定血清ROS水平；二硫代二硝基苯甲酸法測定GSHPx活性；黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD 活性；硫代巴比妥酸法測定MDA 水平；GABA 和5-HT 檢測均嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行檢測。

2.4 GABAARmRNA 表達(dá)檢測 用RT-PCR 法檢測。取脊髓背角組織作為標(biāo)本，勻漿，取100μl用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA 的濃度和純度，取10μl根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆?。?μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴增反應(yīng)，并以β-actin 為內(nèi)對照。GABAAR 基因引物由Invitrogen公司設(shè)計合成。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2min→95 ℃變性10s→65 ℃退火30s→72 ℃延伸35s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5min。PCR 擴增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，溴化乙啶染色，通過凝膠電泳分析系統(tǒng)讀取目的基因灰度值，將目的基因灰度值與β-actin基因灰度值的比值作為目的基因mRNA 的表達(dá)量，目的基因mRNA 的表達(dá)量＝目的基因灰度值／β-actin基因灰度值。具體序列及擴增長度見表1。

表1 引物序列及擴增長度

2.5 GABA 能神經(jīng)元凋亡檢測 采用Tunel法檢測。取脊髓背角組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定24h，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片撈于APES防脫玻片上（片厚4μm），60 ℃烤箱烘烤2h。按照Tunel凋亡檢測試劑盒的說明步驟進(jìn)行操作，最后二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0軟件。計量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果 所有大鼠術(shù)后精神狀態(tài)和攝食良好，沒有死亡病例，沒有出現(xiàn)自噬行為。模型組和聯(lián)合組造模后第14d大鼠出現(xiàn)左后肢不穩(wěn)步態(tài)，各足趾不能隨意展開，大鼠行走時呈現(xiàn)跛行步態(tài)，提示CCI造模成功［5］。

3.2 ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量檢測結(jié)果 4 組ROS水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝87.88，P ＜0.001）；4組MDA 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝298.31，P ＜0.001）；4 組GSH-Px水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝944.53，P ＜0.001）；4組SOD 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝407.57，P ＜0.001）；4組GABA 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝26.89，P ＜0.001）；4組5-HT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝42.65，P ＜0.001）；與對照組比較，假手術(shù)組各指標(biāo)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；模型組血清ROS、MDA 水平均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），GSH-Px、SOD活性和GABA、5-HT 含量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)合組ROS、MDA 水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量上升或顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。以上結(jié)果見表2。

表2 各組ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量比較 （±s，n ＝20）

表2 各組ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量比較 （±s，n ＝20）

注：與對照組比較，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01；與模型組比較，c：P ＜0.05，d：P ＜0.01

組別ROS（ng／L）MDA（mol／L）GSH-Px（U／ml）SOD（U／ml）GABA（μmol／g）5-HT（nmol／g）對照組26.89±9.86 7.01±1.56 116.36±4.62 201.88±18.65 2.35±0.86 2.89±0.63假手術(shù)組25.98±10.32 7.96±1.23 113.29±5.68 219.53±21.32 2.54±0.91 3.01±0.61模型組68.25±9.65b 24.06±3.06b 36.57±3.02b 94.25±8.65b 0.84±0.16b 1.15±0.52b聯(lián)合組28.54±8.65d 8.05±2.18d 90.11±7.26c 192.23±16.36c 1.86±0.36d 2.56±0.58d

3.3 GABAAR mRNA 表達(dá)檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組GABAAR mRNA 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)合組GABAAR mRNA 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 各組GABAAR mRNA 表達(dá)比較（±s，n ＝20）

3.4 GABA 能神經(jīng)元凋亡檢測 細(xì)胞核中有棕褐色著染者為凋亡細(xì)胞，染色呈棕褐色的細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變小、變形、細(xì)胞核發(fā)生固縮現(xiàn)象；而正常細(xì)胞的胞核很少染色。模型組呈棕褐色細(xì)胞即凋亡細(xì)胞較正常組多，聯(lián)合組凋亡細(xì)胞較模型組下降，見圖2。

4 討論

動物模型的制備是進(jìn)行動物實驗研究的前提，我們參考有關(guān)坐骨神經(jīng)痛動物模型的制備研究報道，采取改良的CCI模型制備方法，此種方法具有減少干擾因素，使動物維持痛覺持久，更有利于對動物長期慢性疼痛的觀察和研究［4］。

圖2 各組GABA 能神經(jīng)元凋亡形態(tài)學(xué)比較（Tunel法×40）

關(guān)于坐骨神經(jīng)痛的病理機制研究問題，研究認(rèn)為ROS通過減少脊髓GABA 的釋放而引起，因此，GABA 能神經(jīng)元的氧化損傷和功能變化是坐骨神經(jīng)痛重要病理環(huán)節(jié)［6］，而最近的研究則指出，GABA 能神經(jīng)元的氧化損傷和功能變化是坐骨神經(jīng)痛發(fā)生的重要病理機制［3］。在臨床工作中我們注意到壯醫(yī)針挑和藥線點灸環(huán)跳穴、陽陵泉、足三里等對坐骨神經(jīng)痛療效確切，但對于其治療機制的研究還沒有開展，我們結(jié)合最新的有關(guān)坐骨神經(jīng)痛研究進(jìn)展，試圖通過動物實驗研究進(jìn)行初步探討。

已有研究［7-8］表明針刺陽陵泉能提高SOD 活性，能夠減輕缺血再灌注和MPTP誘導(dǎo)帕金森大鼠模型新紋狀體的氧化損傷。同時，研究［9-10］表明針刺和點灸環(huán)跳穴、足三里等能提高血清SOD 含量、降低MDA 水平，提示針刺和點灸環(huán)跳穴、足三里等穴位具有抗氧化損傷GABA 能神經(jīng)元的作用。另外有研究顯示電針有可能通過增加脊髓內(nèi)GABA 含量及增強其受體的活動而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［11］，而5-HT 能激活5- HT2A 受體在GABA 能中間神經(jīng)元的表達(dá)從而增加GABA 含量發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［12］，GABA 的合成增多 激 活GABA 受體，GABA 受體mRNA 表達(dá)增加，對神經(jīng)元有保護作用［13］。在本實驗中觀察到，與對照組比較，模型組血清ROS、MDA 水平均顯著上升，GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量均顯著下降。與模型組比較，聯(lián)合組ROS、MDA 水平均顯著下降，GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量上升或顯著上升，GABAAR mRNA 表達(dá)上升，和上述的有關(guān)報道是一致的，提示壯醫(yī)藥線點灸和針挑療法能提高抗氧化能力、改善GABA 神經(jīng)元功能的氧化損傷狀況，同時，從GABA 能神經(jīng)元凋亡檢測結(jié)果分析，推測壯醫(yī)藥線點灸和針挑療法還可能對GABA 能神經(jīng)元有保護作用，但需要進(jìn)一步的實驗探討。

壯醫(yī)藥線點灸和針挑療法是壯醫(yī)的特色醫(yī)療技法，是在壯醫(yī)藥理論指導(dǎo)下應(yīng)用的，壯醫(yī)長期的醫(yī)療實踐表明藥線點灸具有溫經(jīng)、通絡(luò)、止痛的效果，足三里是常用的壯醫(yī)強身保健穴位［14］，藥線點灸通過疏通人體“龍路”、“火路”，通行血脈、祛邪外出，保持“氣血平衡”，達(dá)到壯醫(yī)藥理論中“天、地、人”三氣同步的健康和諧狀態(tài)。針挑療法也是壯醫(yī)特色療法，壯醫(yī)名家黃瑾明認(rèn)為壯醫(yī)針挑的鮮明特色在于針挑通過“谷道”、“水道”、“氣道”、“龍路”、“火路”五條道路（即“三道兩路”）進(jìn)行傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)。壯醫(yī)專家黃漢儒［15］、龐聲航等［16］、王柏燦［17］等認(rèn)為針挑療法的作用機制是挑刺可以激發(fā)人體正氣，將郁滯體內(nèi)的有形或無形之毒從體表針挑點驅(qū)出，達(dá)到排毒逐瘀，恢復(fù)“天、地、人”三氣同步狀態(tài)。體現(xiàn)了壯醫(yī)藥理論“調(diào)氣、祛毒”的治療原則。對藥線點灸和針挑療法的研究目前多集中于臨床報道，而關(guān)于其治療疾病的機制研究仍有待更多的關(guān)注。

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