急性腦出血大鼠腸屏障功能的變化

張繼龍，武國艷，汪連珍，李立為，王智超

急性腦出血大鼠腸屏障功能的變化

張繼龍，武國艷，汪連珍，李立為，王智超

目的：研究急性腦出血對腸粘膜屏障功能的影響。方法：成年雄性Wistar大鼠60只，隨機分為腦出血組和對照組各30只。腦出血組采用立體定向技術(shù)將大鼠自體尾動脈不抗凝動脈血液50 μL緩慢注入尾狀核制備腦出血模型，對照組注射等量生理鹽水。2組分別于造模前和造模后0.5、3、6、12、24 h檢測血漿二胺氧化酶（DAO）活性和D-乳酸（D-Lac）濃度，于造模前和造模后12、24 h檢測血漿內(nèi)毒素（LPS）濃度；造模后24 h取空腸l cm，光鏡下觀察腸粘膜。結(jié)果：與對照組比較，腦出血組造模后12、24 h DAO活性和造模后6、12、24 h D-Lac濃度及造模后12、24 h LPS濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05或＜0.01）。光鏡下觀察，腦出血組小腸存在病理性損傷，對照組小腸結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論：急性腦出血早期即發(fā)生腸屏障功能障礙。

急性腦出血；腸屏障功能；二胺氧化酶；D-乳酸；內(nèi)毒素

急性腦出血對機體來說是一個急性強刺激，可引起全身應(yīng)激，引發(fā)多個器官的病理生理改變，甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。腸道被認為是機體應(yīng)激的中心器官，在MODS的形成中具有重要作用。大量研究證實，腸道不僅是MODS的“受損”器官，又是MODS的“始動”器官[1]，因此保護腸屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性是有效防治MODS的重要環(huán)節(jié)[2]。腦出血應(yīng)激引起的消化道癥狀在臨床上很常見[3-5]，如應(yīng)激性潰瘍、腸麻痹、腹瀉等，但排除其他干擾因素從動物實驗建立腦出血模型研究是否存在腸道粘膜屏障改變尚未見報道。因此，本研究避開缺氧、感染等因素影響，觀察大鼠腦出血能否引起腸屏障功能的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年清潔級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（240±20）g，均由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物分籠飼養(yǎng)，自由活動。隨機分為腦出血組和對照組各30只。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型制備 參照Deinsberger等[6]的方法制備大鼠腦出血模型。①麻醉：術(shù)前 24 h禁食，8 h禁水。10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉。②生命體征檢測：麻醉后氣管插管，多參數(shù)監(jiān)測儀監(jiān)測心電、呼吸，右股動脈持續(xù)監(jiān)測血壓；保持舌下血氧飽和度＞95%，如低于95%則經(jīng)氣管插管吸氧；置入胃管。③模型制作：將其俯臥位固定在立體定位儀，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使大鼠前、后囟處于同一水平，沿頭皮正中切一長約10 mm切口，無菌操作暴露前囟，定位于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進針深度為5.5 mm（即尾狀核位置）。斷尾取血50 μL，立即注入更換微量注射器內(nèi)，血液靜置5 min使之充分凝固。用微量進樣器在8～10 min內(nèi)緩慢、多次、少量注入，注血結(jié)束后留針10 min緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。所有操作均在無菌條件下進行，術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由活動進食水。對照組注射等量生理鹽水，其余同腦出血組。④營養(yǎng)：所有大鼠通過胃管給予腸內(nèi)營養(yǎng)，24 h共鼻飼腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液250 mL（速度約70 mL/h），間斷給予生理鹽水鼻飼（300 mL/24 h），靜脈給予10%葡萄糖、林格氏液或生理鹽水，入液量每 24 h 100 mL/kg，總能量攝入30 kcal/kg。

1.2.2 標本采集和檢測 2組分別在造模前和造模后0.5、3、6、12、24 h抽血，裝入肝素抗凝管，取血 3 mL，4℃低溫離心機，3 000轉(zhuǎn)/分，離心15 min，分離血漿，取上清液1 mL，－70℃保存?zhèn)溆?，集中檢測血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、D-乳酸（D-lactate，D-lac）。2組分別在造模前和造模后12、24 h共3個時間點抽血，應(yīng)用經(jīng)過去熱源肝素化處理的內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）專用試管，取血3 mL，4℃低溫離心機，離心15 min，在超凈臺內(nèi)嚴格無菌操作，分離血漿，取上清液1 mL，放入同樣的試管，－70℃保存?zhèn)溆?，集中檢測LPS。腦出血組所有大鼠于造模后24 h標本采取完畢后，行腦組織切片，證實腦出血。

1.2.3 腸標本制備 2組大鼠造模后24 h取空腸l cm，生理鹽水沖洗，10%甲醛固定，備用HE染色。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，重復(fù)計量資料的方差分析、配對 檢驗，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦出血模型觀察

腦出血組所有大鼠清醒后均出現(xiàn)拖步行走、肢體偏癱、旋轉(zhuǎn)爬行等，造模后24 h腦組織切片證實腦出血，說明造模成功，見圖1。對照組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，腦內(nèi)亦無血腫形成。

圖1 腦出血組大鼠造模24 h后腦組織切片

2.2 血漿DAO活性變化

腦出血組的血漿DAO于造模前、造模后0.5、3、6 h與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；造模后12 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；造模后24 h高于對照組，有顯著性差異（＜0.01），見表1。

表1 2組各時間點血漿DAO活性結(jié)果比較（U/mL，±s）

表1 2組各時間點血漿DAO活性結(jié)果比較（U/mL，±s）

注：與對照組比較，①＜0.05，②＜0.01

組別只數(shù)DAO活性造模前造模后0.5 h造模后3 h造模后6 h造模后12 h造模后24h對照組300.351±0.0720.346±0.1070.374±0.0650.380±0.0860.363±0.0760.348±0.027腦出血組300.347±0.0810.373±0.0710.367±0.0570.416±0.0920.527±0.074①0.647±0.081②

2.3 血漿D-lac濃度變化

腦出血組的血漿D-lac于造模前、造模后0.5、3 h與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；造模后6 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；造模后12、24 h高于對照組，有顯著性差異（＜0.01），見表2。

表2 2組大鼠各時間點血漿D-lac活性變化比較（μg/mL，±s）

表2 2組大鼠各時間點血漿D-lac活性變化比較（μg/mL，±s）

注：與對照組比較，①＜0.05，②＜0.01

組別只數(shù)D -l a c濃度造模前造模后0 . 5 h造模后3 h造模后6 h造模后1 2 h 造模后2 4 h對照組3 04 . 1 8 9 ± 0 . 7 1 24 . 0 5 9 ± 0 . 1 7 44 . 4 8 6 ± 0 . 6 5 44 . 6 2 5 ± 0 . 7 1 54 . 1 3 2 ± 1 . 0 1 2 4 . 1 6 7 ± 0 . 9 2 3腦出血組3 04 . 1 7 3 ± 0 . 9 4 54 . 4 5 9 ± 0 . 7 1 24 . 8 6 9 ± 0 . 7 9 25 . 6 7 4 ± 0 . 1 7 9①6 . 7 4 1 ± 1 . 0 7 8②7 . 1 3 4 ± 0 . 9 8 9②

2.4 血漿LPS濃度變化

表3 2組大鼠各時間點血漿LPS濃度比較（EU/mL，±s）

表3 2組大鼠各時間點血漿LPS濃度比較（EU/mL，±s）

注：與對照組比較，①＜0.05，②＜0.01

組別只數(shù)LPS濃度造模前造模后1 2 h 造模后2 4 h對照組3 00 . 3 7 8 ± 0 . 0 3 70 . 4 1 2 ± 0 . 0 6 2 0 . 3 9 1 ± 0 . 0 7 1腦出血組3 00 . 3 5 7 ± 0 . 0 6 50 . 7 0 8 ± 0 . 0 4 2①0 . 8 4 5 ± 0 . 3 2 1②

2.5 腸粘膜病理學改變

HE染色光鏡下觀察，對照組空腸結(jié)構(gòu)正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整，呈高柱狀上皮，間質(zhì)無水腫，見圖2A。腦出血組空腸可見部分絨毛水腫、斷裂、脫落，固有層血管充血，中性粒細胞浸潤及淋巴細胞浸潤、少量柱狀上皮壞死，腸腔炎性滲出，見圖2B。

圖2 對照組（A）、腦出血組（B）腸粘膜病理學改變（HE染色，×200）

3 討論

腦出血時機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，腸道灌注急劇減少，腸粘膜水腫、糜爛，腸粘膜屏障功能破壞，細菌、毒素移位透過腸粘膜屏障，引起腸功能衰竭，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)。DAO是一種含有脫氨的腐胺和組胺的細胞內(nèi)酶，主要分布在成熟的絨毛上皮，能準確反映腸粘膜的完整性、成熟度和損傷程度[7,8]。當腸粘膜遭受嚴重損傷，由于上皮破壞，DAO大量釋放入血，可引起血漿DAO活性升高。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血組在造模后12、24 h血漿DAO活性明顯高于假手術(shù)組（＜0.05或＜0.01），說明在腦出血時，即使沒有明確的低血壓、休克、缺氧和感染等，腸粘膜細胞仍然存在損傷。

哺乳動物既不產(chǎn)生D-lac，也不能或僅能緩慢代謝D-lac，正常情況下血中其水平很低。人體內(nèi)的D-lac主要由胃腸道的細菌發(fā)酵產(chǎn)生，腸道菌群中多種細菌均可產(chǎn)生。當腸道發(fā)生急性應(yīng)激致缺血時，局部細菌大量繁殖，破壞腸粘膜生物屏障，腸粘膜通透性增加。此時，腸道細菌產(chǎn)生的大量D-lac透過受損腸粘膜經(jīng)循環(huán)進入血液，使血液中D-lac水平升高。因此檢測其外周血水平可間接反映腸粘膜損害程度和通透性變化[9,10]。本研究表明，造模后6、12、24 h腦出血組D-lac濃度高于假手術(shù)組（＜0.05或＜0.01），說明D-lac能較早反映腸粘膜損傷。

LPS是革蘭陰性菌的外膜成分。由于健全的腸道屏障作用，LPS被限制在腸腔內(nèi)，并不進入體循環(huán)。當機體處于缺血、創(chuàng)傷、燒傷或受到電離輻射后，腸道屏障功能易遭受破壞，而發(fā)生嚴重的LPS移位，使得血中的LPS濃度增高，而內(nèi)毒素血癥是腸粘膜損害的突出表現(xiàn)，腸源性內(nèi)毒素血癥又可以導致腸道功能進一步受損，形成惡性循環(huán)。同時在臨床中，LPS的檢測較血液細菌培養(yǎng)迅速、簡便，可早期診斷腸粘膜損害。本研究顯示，造模后12、24 h，腦出血組LPS濃度高于對照組（＜0.05或＜0.01），說明腦出血組存在腸屏障損害。

綜上所述，大鼠腦出血時存在腸屏障功能障礙，提示腦出血時應(yīng)盡早干預(yù)及調(diào)整腸道功能，對改善預(yù)后有積極意義。

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Changes of Intestinal Barrier Function of Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

Objective:To observe the changes of intestinal barrier function of rats with acute cerebral hemorrhage.Methods:Sixty Wistar rats were randomly divided into cerebral hemorrhage group and control group with 30 rats in each group.The cerebral hemorrhage model was established by stereotactic infusing 50 μL autologous caudate artery blood.The control group were only infused with equal normal saline.The concentration of plasma diamine oxidase(DAO)and activity of D-lactate(D-lac)in plasma were measured before operation and 0.5,3,6,12,24 h after operation.The concentration of plasma Lipopolysaccharide (LPS)was measured before operation and 12,24 h after operation.The jejunums(1 cm)of the both groups were taken at 24 h after operation,and light microscopic examination was performed for morphological measurement of intestinal epithelial cells.Results:Compared with those in the control group,the DAO and LPS concentrations at 12,24 h and the D-lac levels at 6,12,24 h after operation were significantly increased in the cerebral hemorrhage group (＜0.05 or 0.01).Under the light microscope,intestinal mucosal injuries were observed in the cerebral hemorrhage group whereas no obvious changes occurred in the control group.Conclusion:Intestinal barrier function was damaged in the early stage of cerebral hemorrhage.

acute cerebral hemorrhage;intestinal barrier function;diamine oxidase;D-lactate;Lipopolysaccharide

R741;R743.34

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.005

武漢市第一醫(yī)院急診科武漢430022

2014-01-21

武國艷zhangjilong73@163. com