我國近海中度嗜鹽菌的分離篩選及其產(chǎn)酶多樣性分析

產(chǎn)竹華，劉洋，王昭凱，鐘添華，曾潤穎＊

（1.國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建廈門361005）

1 引言

中度嗜鹽菌（Moderately halophilic bacteria）指一類能夠在NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～15%之間最適生長能力的極端微生物類群［1－2］，廣泛生活于近海、鹽湖、鹽場、高鹽土壤和鹽漬食物等環(huán)境［3］。由于中度嗜鹽菌獨特的生理生化特性，易于在高鹽環(huán)境下生長及可以利用多種有機物作為碳源和氮源，決定了其在酶制劑生產(chǎn)、食品工業(yè)、污水處理等方面的具有可能的應(yīng)用價值［4－5］。

嗜鹽菌由于其獨特遺傳背景和代謝途徑，使其產(chǎn)生的生物酶在食品、化工、環(huán)保等領(lǐng)域有重大的應(yīng)用潛力，因此其逐漸成為研究的熱點。Sanchez等［6］從幾百株中度嗜鹽菌得到多種胞外水解酶并對酶活性進行了詳細(xì)的研究，同時，他們也分離得到高產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌［7］。Mohammad等［8］從中度嗜鹽菌Salinivibriosp.AF－2004中得到分泌性的堿性金屬蛋白酶，并進行了分離純化，它具有較寬的pH生長范圍和鹽耐受性，為它的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［9］。Hiroko Tokunaga等［10］研究了由中度嗜鹽菌中的134個氨基酸組成的二聚體－核酸二磷酸激酶，并對它的結(jié)構(gòu)進行了分析。Moozegar等［11］人對Halobacillus sp.MA－2在高溫及高鹽條件下分泌的淀粉酶做了詳細(xì)的研究。這些工作極大地豐富了我們對中度嗜鹽菌產(chǎn)酶的認(rèn)識。

本文從天津濱海、山東東營、江蘇連云港、福建廈門、海南三亞等地近海采集樣品，富集、分離篩選中度嗜鹽菌。利用底物特異性實驗分析了嗜鹽菌株的產(chǎn)酶多樣性。通過16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析產(chǎn)酶嗜鹽菌株的分類地位，從而可以了解各菌株的系統(tǒng)進化和產(chǎn)酶多樣性，為進一步研究嗜鹽微生物資源提供了參考。

2 材料與方法

2.1 試驗樣品

從天津濱海（39°06′N，117°43′E）、山東東營（37°32′N，118°55′E）、江蘇連云港（34°49′N，119°14′E）、福建廈門（24°32′N，118°22′E）、海南三亞（18°12′N，109°28′E）等地近海采集樣品。樣品放置4℃冰箱保存，然后進行菌株的篩選。

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

中度嗜鹽菌富集，篩選培養(yǎng)基（g／L）：NaCl 100，葡萄糖10，酵母粉10，蛋白胨5，KCl 2.0，MgSO4· 7H2O 1.0，CaCl20.36，NaHCO30.06，F(xiàn)eCl30.001，pH 7.4～7.6。固體培養(yǎng)基加入瓊脂15～20。

基本培養(yǎng)基（g／L）：NaCl 100，KCl 2.0，MgSO4· 7H2O 1.0，CaCl20.36，F(xiàn)eCl30.001，pH 7.4～7.6。固體培養(yǎng)基加入瓊脂15～20。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：NaCl 100，葡萄糖10，蛋白胨10，酵母粉5。

2.3 實驗方法

2.3.1 菌株的富集和分離純化

稱取樣品（土樣或水樣）1g或1mL置于250mL裝液量50mL篩選培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)3～5d，富集菌體；然后取富集的菌液逐級稀釋從10－2到10－8，取2～3個梯度涂平板；37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d長出單菌落，挑取單菌落劃線、培養(yǎng)，直到得到純培養(yǎng)菌株。用斜面劃線試管和－70℃甘油管兩種方法保存。

2.3.2 菌落特征

劃線接種于嗜鹽培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3d，觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。

2.3.3 菌體特征

采用革蘭氏染色法和芽孢染色法［12－13］，通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對菌體形態(tài)進行觀察。

2.3.4 部分生理生化特征

依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［14］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第9版）》［15］進行常規(guī)生化鑒定。

2.3.5 16SrRNA基因擴增和系統(tǒng)進化分析

使用BioTeke試劑盒提取細(xì)菌總DNA。以細(xì)菌總DNA為模板，用16SrRNA通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′），1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）進行PCR擴增菌株16SrRNA［16］。PCR產(chǎn)物送交到Invitrogen公司測定。測序得到的16SrRNA基因序列通過BLASTN（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）進行比對。

2.3.6 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

提交各嗜鹽菌株的16SrRNA基因序列在EMBL數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取與之相似性較高的模式種的16SrRNA基因序列，采用MEGA4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap1000次進行穩(wěn)定性驗證。

2.4 產(chǎn)酶中度嗜鹽菌的篩選

2.4.1 產(chǎn)蛋白酶中度嗜鹽菌的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%脫脂奶粉，制成平板。在平板上劃線中度嗜鹽菌株，37℃培養(yǎng)1周后觀察有無透明圈出現(xiàn)［17］。

2.4.2 產(chǎn)淀粉酶中度嗜鹽菌的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%可溶性淀粉，制成平板。在平板上點種嗜鹽菌株，37℃培養(yǎng)1周后用路戈氏碘液檢驗，觀察有無透明圈出現(xiàn)［18］。

2.4.3 產(chǎn)酯酶中度嗜鹽菌的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%Tween80，制成平板。在平板上劃線中度嗜鹽菌株，37℃培養(yǎng)1周后觀察有無白色暈圈［19］。

2.4.4 產(chǎn)纖維素酶中度嗜鹽菌的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%羧甲基纖維素鈉和0.2%剛果紅，制成平板。在平板上點種嗜鹽菌株，37℃培養(yǎng)觀察有無透明圈出現(xiàn)［20］。

2.5 酶活力測定方法

（1）蛋白酶活力測定方法：參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蛋白酶活力測定方法》SB／T10317－1999進行測定［21］。

（2）淀粉酶活力的測定：采用YoungJ.Y00改良法［22］。

（3）酯酶活力測定法：采用改進過的α－乙酸萘酯比色法［23－25］測定酶活。

（4）纖維素酶活力測定參照文獻［26－27］，酶活力按照國際單位規(guī)定定義為：每分鐘催化纖維素水解生成1μmol葡萄糖的酶量為1個酶活力單位U。

3 結(jié)果與分析

3.1 部分生理生化特征

通過對天津、三亞、連云港、廈門、東營等地近海和鹽田的樣品進行富集、分離純化。得到26株中度嗜鹽菌，生長3～4d后，菌落均為干燥或濕潤，大多菌株的菌落為白色，其次為黃色。菌株形態(tài)和菌落顏色具有多樣性。革蘭氏染色顯示革蘭氏陽性菌占絕對優(yōu)勢，各株菌的部分生理生化特征見表1。

表1 中度嗜鹽菌的部分生理生化性質(zhì)

3.2 中度嗜鹽菌產(chǎn)酶多樣性

經(jīng)過篩選得到26株產(chǎn)酶嗜鹽菌株，分別對26株菌株進行底物特異性試驗，驗證了菌株的產(chǎn)酶情況。發(fā)現(xiàn)13株菌產(chǎn)蛋白酶，其中LYG1－4、WJ5－1、WJ5－3、TJ5－2、TJ7－4和BZ2－2產(chǎn)蛋白酶能力較強；19株菌產(chǎn)淀粉酶，其中TJ6－1、TJ8－1產(chǎn)酶能力較強；13株菌產(chǎn)酯酶，其中TJ3－2、TJ9－5、TJ12－3、LYG1－1、LYG2－5、LYG3－5產(chǎn)酶能力較強；4株菌產(chǎn)纖維素酶，分別屬于Virgibacillus、Halobacillus、 Halomonas等屬。從表2中可以看出，沒有一株菌可以同時產(chǎn)4種酶，有6株菌同時產(chǎn)3種酶，有11株菌能產(chǎn)2種酶，表明了中度嗜鹽菌產(chǎn)酶的多樣性。

表2 中度嗜鹽菌產(chǎn)酶多樣性

3.3 嗜鹽菌產(chǎn)酶分析

3.3.1 中度嗜鹽菌株產(chǎn)蛋白酶

雖然蛋白酶的種類很多，而且有些已在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。但應(yīng)用環(huán)境往往會影響到酶的活力，特別是高鹽環(huán)境下的活力。因而需要適應(yīng)于廣譜pH、溫度、鹽度的酶。中度嗜鹽菌特殊的生理生化條件決定了其所產(chǎn)蛋白酶的特殊性，耐鹽、較寬的pH和溫度范圍菌保持較高活性。本工作中篩選到產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌有13株，占產(chǎn)酶菌株總量的50%。如圖1顯示，在脫脂奶粉平板上生長的中度嗜鹽菌生長1周后，菌落周圍出現(xiàn)透明圈，說明這些菌株能產(chǎn)生蛋白酶。通過搖瓶實驗，測定產(chǎn)酶菌株的酶活（3組重復(fù)取平均），結(jié)果表明LYG1－4、WJ5－1、WJ5－3、TJ5－2、TJ7－4和BZ2－2產(chǎn)蛋白酶能力較強，其中BZ2－2菌株酶活力最高，達到765U／g。

3.3.2 中度嗜鹽菌株產(chǎn)淀粉酶

圖2顯示，在淀粉平板上生長的中度嗜鹽菌生長1周后，將碘液滴在菌苔上，如果周圍無藍色，而對照仍然為藍色，說明該菌株能產(chǎn)生淀粉酶（圖2）。淀粉酶都需要特定的溫度、pH值和鹽度范圍，故對淀粉酶活較高的中度嗜鹽菌進行分離和鑒定，有助于發(fā)現(xiàn)新的淀粉酶來適應(yīng)新的工業(yè)需要。通過搖瓶實驗，測定產(chǎn)酶菌株的酶活（3組重復(fù)取平均），結(jié)果表明TJ6－1、TJ8－1產(chǎn)酶能力較強，其中菌株TJ6－1酶活力達到387U／g。

圖1 菌株產(chǎn)蛋白酶的照片

圖2 菌株產(chǎn)淀粉酶（左：對照，右：產(chǎn)淀粉酶菌株）

3.3.3 中度嗜鹽菌株產(chǎn)酯酶

在酯酶篩選平板上點種嗜鹽菌株，培養(yǎng)一定時間后發(fā)現(xiàn)有些生長的菌株周圍產(chǎn)生白色暈圈，說明該菌株產(chǎn)生酯酶（圖3）。酯酶菌株的獲得說明中度嗜鹽菌的產(chǎn)酶具有多樣性，也為更好的利用中度嗜鹽菌提供了參考。從圖中可以看出，菌株在固體平板上產(chǎn)酯酶的情況較好，明顯出現(xiàn)白色暈圈。通過搖瓶實驗，測定胞外和胞內(nèi)酶活（3組重復(fù)取平均），該酶大部分屬于胞外酶。結(jié)果表明TJ3－2、TJ9－5、TJ12－3、LYG1－1、LYG2－5、LYG3－5產(chǎn)酶能力較強，其中菌株LYG3－5的酶活力達到582U／g。

3.3.4 中度嗜鹽菌株產(chǎn)纖維素酶

在纖維素的平板上點種嗜鹽菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有4株菌能夠生長。進一步通過搖瓶實驗，測定纖維素酶活力（3組重復(fù)取平均），分別為248U／g、476U／g、207U／g、356U／g，說明這4株菌產(chǎn)纖維素酶，分別屬于Virgibacillus，Halobacillus，Halomonas屬，產(chǎn)纖維素酶的嗜鹽菌株占總菌數(shù)不到20%。

圖3 菌株產(chǎn)酯酶的情況

3.4 系統(tǒng)進化分析

經(jīng)過篩選，得到了至少產(chǎn)一種胞外酶的26株嗜鹽菌，其中有11株與鹽單胞菌屬的細(xì)菌相近，占分離細(xì)菌總數(shù)的42.31%，其次有6株與Idiomarina屬的細(xì)菌相近，是占優(yōu)勢的類群。16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明大部分菌株的進化地位相當(dāng)明確（見圖4），26株菌分別屬于7個屬（Halomonas，Oceanobacillus，Idiomarina，Virgibacillus，Pontibacillus，Halobacillus和Marinilactibacillus）的13個不同的種，系統(tǒng)進化地位不等，表明中度嗜鹽菌分布的多樣性和廣泛性，以及資源的豐富性，為嗜鹽微生物以及嗜鹽酶的研究提供了參考。

4 討論

4.1 中度嗜鹽菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性

通過對天津、三亞、連云港、廈門、東營等地近海或鹽田的樣品進行分離篩選和鑒定，得到26株產(chǎn)酶菌株，分別屬于13個種，7個屬。其中WJ5－1，TJ3－2分別屬于Halomonas，Idiomarina屬，與各屬中的模式菌株Halomonas variabilis DSM 3051T，Idiomarina zobellii KMM 231T的16SrRNA基因同源性分別為97.62%、97.83%，可能代表該屬內(nèi)的新種，要確定該菌是否為新種需通過GC含量、DNA分子雜交等實驗進一步分析和鑒定［28］。表明我國近海中度嗜鹽菌分布多樣性以及系統(tǒng)進化多樣性。

4.2 中度嗜鹽菌產(chǎn)酶多樣性

對嗜鹽菌株進行底物特異性試驗表明，篩選到的菌株沒有一株可以同時產(chǎn)4種酶，有6株菌同時產(chǎn)3種酶，有11株菌能產(chǎn)2種酶。通過嗜鹽產(chǎn)酶情況分析，表明我國近海中度嗜鹽菌產(chǎn)酶的多樣性。經(jīng)過性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)嗜鹽酶活力最適鹽度為10%，且在NaCl濃度為20%、pH 10和溫度20～55℃條件下均有活性，且活性都保持在50%以上。嗜鹽酶獨特的生理特性將為嗜鹽菌在工業(yè)應(yīng)用方面提供重要參考。

圖4 中度嗜鹽菌菌株基于16SrRNA基因序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

4.3 中度嗜鹽菌酶的應(yīng)用分析

隨著工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢水的污染越來越嚴(yán)重，電子廢水、造紙廢水、高鹽廢水的治理需要更高的成本。中度嗜鹽菌酶具有能在高鹽、較高pH以及較寬溫度均有活性，為工業(yè)廢水的治理提供了一個新的思路。因此，開發(fā)出高酶活的嗜鹽菌酶和能較好治理工業(yè)廢水的嗜鹽菌酶是下一步的研究重點。

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