雙水相-微波提取苧麻皮中總黃酮及抗氧化性研究

何慧蓉，黃 藝，鄧選利，但 梅，劉德兵，阮尚全，2*

1內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院;2 四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)江 641112

苧麻為蕁麻科苧麻屬多年草本植物，是一種重要的纖維性經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)具有豐富的自然資源，被稱為“中國(guó)草”，主要用作紡織工業(yè)原料，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%，四川達(dá)州因原麻品質(zhì)優(yōu)良已成為苧麻加工企業(yè)競(jìng)相購(gòu)買的優(yōu)質(zhì)原料［1-3］。苧麻副產(chǎn)物苧麻皮通常是被作為廢棄物處理，因其纖維強(qiáng)度較高，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境，因此將其資源化具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。黃酮類化合物是一類低分子量而廣泛分布于植物界多的天然植物成分，為植物多酚類的代謝產(chǎn)物，因具有很好的清除自由基和抗氧化能力，對(duì)抗癌腫瘤、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)具良好的作用，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度重視［4，5］。本實(shí)驗(yàn)采用雙水相-微波輻射提取了苧麻皮中的黃酮，建立了苧麻皮中黃酮提取的新方法，并對(duì)萃取物清除超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，對(duì)苧麻生產(chǎn)中的廢棄物利用具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用苧麻皮采于達(dá)州市大竹縣。蘆丁(BR)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Uwave-1000 微波.紫外.超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀(上海新儀);T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析);TD-5 臺(tái)式低速離心機(jī)(四川蜀科);DFT-100 型中藥粉碎機(jī)(溫嶺);AE240 電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

苧麻皮→烘干→粉碎→過篩→微波提取→分離→定容→顯色→測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0200 g 于100 mL 容量瓶，用30%乙醇溶解并定容，取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 比色管中，采用文獻(xiàn)［6］方法測(cè)定。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，用最小二乘法作線性回歸曲線。實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:A=0.0114C-0.0019，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，蘆丁濃度在8.0～56.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 黃酮的提取

烘干粉碎樣品，準(zhǔn)確稱取1.000 g，加入30 mL 40%的乙醇溶液和硫酸銨0.2 g/mL 形成雙水相，于微波中提取，微波功率為200 W，微波時(shí)間為120 s，離心分離，離心液用蒸餾水定容制成100 mL。取2 mL 溶液于比色管中，加入30%乙醇8 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，6 min 后加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，6 min 后加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用蒸餾水定容搖勻，于波長(zhǎng)511 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.4 抗氧化性研究

1.3.4.1 清除·OH 活性

H2O2與Fe2+作用產(chǎn)生·OH，水楊酸能與·OH作用產(chǎn)生在510 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收的有色物2，3-二羥基苯甲酸。向反應(yīng)中加入被測(cè)物，則會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，使有色物生成量減少。對(duì)·OH 清除的測(cè)定方法按文獻(xiàn)［7］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 硫酸銨用量對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同用量的硫酸銨。實(shí)驗(yàn)表明:總黃酮提取率隨著硫酸銨用量增加而升高，達(dá)飽和后影響不顯著。其主要原因是，隨著硫酸銨用量的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增大，故黃酮提取率會(huì)增大，但硫酸銨用量飽和與否對(duì)提取率影響不大。因此硫酸銨的用量確定為0.2 g/mL［9，10］。見圖1。

圖1 硫酸銨用量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of the dosage of (NH4)2SO4on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同濃度的乙醇溶液。實(shí)驗(yàn)表明:總黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增加，在乙醇濃度60%處達(dá)到最高，隨后又逐漸降低。因?yàn)辄S酮溶于乙醇，乙醇濃度越高，黃酮更加容易擴(kuò)散到提取劑中來，故提取率會(huì)增加，但在雙水相體系中，乙醇的濃度過高，會(huì)破壞雙水相體系的穩(wěn)定性，從而降低了黃酮的提取率。因此，確定乙醇濃度60%。見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the concentration of ethanol on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同的料液比。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著料液比的增大而增加，在加入40mL 乙醇溶液時(shí)達(dá)到最高，隨后變化不大。由于黃酮醇溶性好，故增加溶劑的用量有利于黃酮向提取液中擴(kuò)散，這樣黃酮提取率會(huì)增加，但原料一定的情況下，多余的乙醇作用不大。所以在料液比1∶40 達(dá)到最高，隨后變化不大，因此選擇料液比1∶40。見圖3。

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ratio of solid solution on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 微波功率對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同微波功率。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著微波功率的增加而增大，在功率為150 W 時(shí)達(dá)到最高，然后降低。微波功率越大對(duì)樣品作用得越充分，黃酮更易擴(kuò)散到溶劑中，黃酮提取率會(huì)增加，但微波功率過大，則升溫速率越大，溫度會(huì)越高，這樣可能導(dǎo)致黃酮被氧化或分解加多，同時(shí)也會(huì)使乙醇揮發(fā)加快，從而使黃酮提取率下降。見圖4。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction yield of total flavonoids

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同提取時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著微波時(shí)間的增加而增大，在微波時(shí)間為100 S 時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低。延長(zhǎng)提取時(shí)間可使目標(biāo)產(chǎn)物提取更徹底，提取率會(huì)增加，但加熱時(shí)間延過長(zhǎng)，可能使黃酮發(fā)生分解或氧化，并且時(shí)間越長(zhǎng)乙醇揮發(fā)得越多，故黃酮提取率會(huì)降低，因此確定提取時(shí)間為100S。見圖5:

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2 提取產(chǎn)物的定性鑒定

取2mL 提取液，加入適量試劑，觀察顏色變化見表1，結(jié)果與文獻(xiàn)一致［11］，由此具有黃酮類化合物存在。

表1 黃酮類化合物的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of the flavonoid

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸銨用量對(duì)總黃酮提取率影響相對(duì)較小，料液比、微波功率、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)提取率影響較大，故選取影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。取三個(gè)水平按L9(34)設(shè)計(jì)成正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal test L9(34)

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of orthogonal experiment L9(34)

實(shí)驗(yàn)表明:料液比、微波功率、提取時(shí)間、乙醇濃度、硫酸銨用量等因素均對(duì)苧麻皮中總黃酮的提取有影響，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)?A ＞B ＞C ＞D。從苧麻皮中提取黃酮的工藝條件最優(yōu)組合為A3B3C3D3，即在硫酸銨用量為0.2 g/mL的條件下:料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取120 s，乙醇濃度70%時(shí)為最佳提取條件。驗(yàn)證試驗(yàn):在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，苧麻皮的黃酮提取率分別為:2.4075%、2.4879%、2.4305%，平均提取率為2.4420%，RSD 為1.6%，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理可行。

2.4 提取物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 清除·OH 活性的測(cè)定

參照1.3.4.1 方法進(jìn)行試驗(yàn)，清除·OH 活性的結(jié)果如圖6。

圖6 黃酮對(duì)·OH 清除率Fig.6 Scavenging rates of total flavonoids to ·OH

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，其·OH 清除率為3.97～83.41%，·OH 清除能力隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

圖7 黃酮對(duì)清除率Fig.7 Scavenging rates of total flavonoids to

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率為3.09～69.33%清除能力隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論

文章采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，雙水相協(xié)同-微波法提取了苧麻皮中的總黃酮，并對(duì)提取產(chǎn)物試驗(yàn)了清除·OH 和活性測(cè)定。最后試驗(yàn)得最佳工藝條件為:硫酸銨用量0.2 g/mL，料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取時(shí)間120 s，乙醇濃度70%。本法作為一種天然產(chǎn)物黃酮提取的新技術(shù)，具有條件溫和，快速的特點(diǎn)。苧麻皮中的黃酮具有良好的抗氧化性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的適用價(jià)值，為今后苧麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定的作用。

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