超聲波輔助大米草總黃酮提取及抗氧化活性研究

羅彩林，溫?fù)P敏，高如承，謝永華，陳淑增

1泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，泉州 362000;2 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108

大米草(Spartina，anglica C.E.Hubbard)系禾本科(Gramineae)大米草屬(Spartina Schreber)植物［1］，是我國1963 年從歐洲引種的一種多年生沿海灘涂生物。大米草能夠防風(fēng)護(hù)堤、促淤造陸，但由于其繁殖力強(qiáng)，瘋長蔓延而超出人們控制的范圍。對我國沿海生態(tài)和海水養(yǎng)殖造成了很大的破壞，因而被稱為“害人草”［2，3］。針對大米草入侵所帶來的一系列后果，國內(nèi)外采取了很多方法來控制，但效果都不盡人意，對其有效防控成了一個世界性的難題。

黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗氧化，抗衰老，抗菌，抗腫瘤，抗病毒等［4，5］，也是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。大米草含有豐富的黃酮類化合物，徐年軍等對大米草提取物及其初級分離樣品進(jìn)行了抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性的篩選，找到了一些有重要生物活性物質(zhì)，成分主要是多糖和黃酮［6］。利用大米草豐富的資源，從中分離純化活性物質(zhì)，變害為寶，對其資源進(jìn)行開發(fā)利用是大米草生態(tài)防控的理想方法。研究超聲波提取大米草總黃酮的工藝條件及總黃酮的抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用大米草資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料：

大米草，采自福建泉州灣沿海灘涂，經(jīng)福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院莊惠如教授鑒定為大米草(Spartina，anglica C.E.Hubbard)，標(biāo)本保存于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實驗室。洗凈后于干燥箱中60 ℃烘干，取出粉碎，過100 目篩備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海原葉生物公司);維生素C(阿特維斯(佛山)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號H44021227);丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗儀器：

多功能粉碎機(jī)(上海高翔食品機(jī)械廠GX-02);電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司DKS11);721 型紫外可見分光光度計(上海光譜);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司FD-1C-50);超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司KQ-500DE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

黃酮化合物的測定以蘆丁為標(biāo)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，相當(dāng)于蘆丁0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg，分別置于10 mL 刻度試管中，各加30%乙醇溶液至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.30 mL，混勻，放置5 min 后加入10%硝酸鋁0.30 mL，搖勻放置6 min 后加入4%氫氧化鈉2.00 mL，再用30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置10 min 后于510 nm 處比色測定，以吸光度A 為橫坐標(biāo)，以蘆丁濃度C(mg/mL)為縱坐標(biāo)，用最小二乘法做線性回歸，得回歸方程:Y=0.1217X-0.1214，R2=0.9998

1.2.2 大米草黃酮的提取及測定方法

準(zhǔn)確稱取5.0 g 大米草粉末，按正交設(shè)計條件提取，殘渣用30%乙醇溶液洗滌3 次，合并濾液，放置2 h 后，離心沉淀20 min，取上層清液5 mL 按亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法測定吸光度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后，得出提取液總黃酮濃度。然后按下式計算總黃酮提取率:E%=m/M ×100%，其中:E%:提取率;m:提取液中總黃酮質(zhì)量(g);M:大米草粉末質(zhì)量(g)。其余上層清液冷凍干燥，得到大米草粗黃酮的干燥品。

1.2.3 大米草黃酮提取工藝條件的優(yōu)化

在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、超聲處理溫度、提取時間4個因素為考察因素，采用L9(34)正交設(shè)計安排試驗，其因素水平見表1。

表1 提取黃酮的實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction of flavonoids

1.2.4 大米草黃酮總抗氧化能力(T-AOC) 測定

準(zhǔn)確稱取大米草粗黃酮的干燥品50 mg，溶解于50 mL 30%乙醇溶液中，再分別稀釋，得到0.05，0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的大米草黃酮溶液，另設(shè)計相同濃度Vc 為對照組，按照南京建成生物工程研究所試劑盒測定說明書進(jìn)行總抗氧化能力(T-AOC)測定。T-AOC 單位定義:在37 ℃時，每mL 黃酮溶液每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值，每增加0.01 時，為一個總抗氧化能力單位(U)。

1.2.5 大米草黃酮抗超氧陰離子活力測定

準(zhǔn)確稱取大米草粗黃酮的干燥品50 mg，溶解于50 mL 30%乙醇溶液中，再分別稀釋，得到0.1，0.2，0.5，0.8，1 mg/mL 的大米草黃酮溶液，另設(shè)計相同濃度Vc 為對照組，按照南京建成生物工程研究所試劑盒測定說明書進(jìn)行抗超氧陰離子活力測定?；盍挝欢x:在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升物質(zhì)在37℃反應(yīng)40 min 所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg 維生素C 所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位(U/L)。

1.2.6 大米草黃酮清除丙二醛活性測定

小鼠肝臟樣品用預(yù)冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干，稱取0.5 g 于玻璃勻漿器，加5 mL 預(yù)冷的生理鹽水，冰上勻漿，即為10%組織勻漿液。將不同濃度的大米草黃酮溶液分別加入小鼠肝臟勻漿，37 ℃保溫2 h 后離心，取上清液，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒測定說明書測定丙二醛(MDA)的量，另設(shè)計相同濃度Vc 為對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米草黃酮最佳提取工藝確定

研究乙醇濃度、料液比、超聲波處理溫度、提取時間4個因素對大米草黃酮提取的影響，通過L9(34)正交試驗，確定最佳提取工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

結(jié)果得出影響大米草黃酮提取率的主次因素是:料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。大米草黃酮類化合物提取的最佳工藝為:A3B1C3D2，即乙醇濃度為80%，提取時間20 min，料液比為1∶30 (g·mL-1)，提取溫度為45 ℃。在擬選定的最佳提取條件下進(jìn)行驗證試驗，所提取的大米草黃酮得率可達(dá)2.03%。根據(jù)方差分析(表3)，料液比和乙醇濃度對大米草黃酮提取率影響顯著(P＜0.05)，而提取溫度對大米草黃酮提取率有一定影響，但影響不顯著(0.10 ＞P ＞0.05)。提取時間對大米草黃酮提取率幾乎沒有影響。

表3 大米草黃酮提取的正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting flavonoids from Spartina

2.2 大米草黃酮的總抗氧化活性

大米草黃酮的總抗氧化活性見圖1，從圖1 可以看出，大米草黃酮的總抗氧化活性隨著濃度的增加逐漸增加，具有良好的量效關(guān)系，濃度越大總抗氧化活性越強(qiáng)。當(dāng)濃度較低時，大米草黃酮的總抗氧化活性和Vc 較為接近，但濃度增加后，大米草黃酮的總抗氧化活性比Vc 更大，且隨著濃度增加，差距有變大的趨勢。

圖1 大米草黃酮總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant activity of flavonoids

2.3 大米草黃酮清除丙二醛的活性

大米草黃酮清除丙二醛活性見圖2。由圖可知隨著大米草黃酮濃度的增加，小鼠肝臟勻漿中丙二醛的含量逐漸降低，說明大米草黃酮能有效清除小鼠肝組織勻漿體外生成的氧化脂質(zhì)(MDA)，這與張曉玲等的研究結(jié)果一致［7］。相同條件下，低濃度的大米草黃酮清除丙二醛活性比Vc 還要高。

圖2 大米草黃酮清除丙二醛的能力Fig.2 Flavonoids removal ability of MDA

2.4 大米草黃酮抗超氧陰離子活力

大米草黃酮抗超氧陰離子活力見圖3。由圖可知，隨著濃度的增加，大米草黃酮和維生素C 的抗超氧陰離子活力逐漸增大，相同條件下大米草黃酮的抗超氧陰離子活力比維生素C 稍低。當(dāng)濃度較高為1.0 mg/mL 時，兩者的抗超氧陰離子活力比較接近，差異不顯著(P ＞0.1)。

圖3 大米草黃酮抗超氧陰離子活力Fig.3 Scavenging activities for superoxide anion radicals of flavonoids

3 討論與結(jié)論

機(jī)體代謝過程中會不斷產(chǎn)生自由基，其性質(zhì)活潑，可通過連鎖的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，包括丙二醛、酮基等，以及新的氧自由基，后者可在機(jī)體各部位攻擊核酸、蛋白質(zhì)、糖類及生物膜系統(tǒng)中的多不飽和脂肪酸等，使這些生物大分子出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受到不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，從而誘發(fā)多種病理損傷［8］。黃酮類化合物可通過不同途徑和機(jī)制抵制對機(jī)體有氧化損傷作用的自由基，從而發(fā)揮其抗氧化作用。清除自由基的最主要機(jī)制，是通過酚羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［9］。

大米草黃酮是良好的天然抗氧化劑。應(yīng)用超聲波技術(shù)，設(shè)計正交實驗，分析得出大米草黃酮最佳提取工藝條件為:乙醇濃度80%，提取時間20 min，料液比1∶30 (g·mL-1)，提取溫度45 ℃。影響大米草黃酮提取率的主次因素是:料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。大米草黃酮總抗氧化活性和抗超氧陰離子活力隨著濃度的增加逐漸增加，呈明顯的量效關(guān)系，并且能有效清除小鼠肝組織勻漿體外生成的氧化脂質(zhì)(MDA)。與人工合成的抗氧化劑維生素C 相比，大米草黃酮的抗氧化效果不比維生素C 差，其中總抗氧化活力和低濃度條件下清除丙二醛的活力還比維生素C 強(qiáng)。我國大米草資源豐富，從中提取有效成分，開發(fā)利用它們的藥用價值，變廢為寶，轉(zhuǎn)害為利，對于防治大米草，保護(hù)原有生態(tài)環(huán)境，服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)均有重要的現(xiàn)實意義。

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