當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

楊 嵐，劉佳麗，郭秉榮，崔 杰，秦雪梅，高曉霞*

1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心;2 山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，太原 030006

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，素有“血家百病此方通”之說(shuō)，鑒于該味藥作用之廣，近年來(lái)對(duì)于其物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性的研究頗多，據(jù)文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道:當(dāng)歸揮發(fā)油具有舒張血管、抗血小板凝集、保護(hù)神經(jīng)等功效，藁本內(nèi)酯則是其中主要的起效成分之一［4］。本課題組前期在研究抗抑郁藥逍遙散的物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí)發(fā)現(xiàn)，逍遙散乙醇提取物經(jīng)石油醚萃取后所得的萃取物抗抑郁活性較高，其中藁本內(nèi)酯為該復(fù)方中當(dāng)歸的主要貢獻(xiàn)成分［5］，并且“逍遙散復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)初探”［6］與“血清藥物化學(xué)”的研究結(jié)果也表明其在大鼠體內(nèi)有明顯入血，因此明確當(dāng)歸中該成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特性勢(shì)在必得。目前，關(guān)于該成分的研究焦點(diǎn)主要集中于藥理活性，有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)的研究卻為數(shù)不多，僅有的幾篇也只以單體或川芎揮發(fā)油中該成分作為研究對(duì)象［7，8］，而同樣作為當(dāng)歸中較為重要的活性成分之一，以當(dāng)歸石油醚萃取物作為給藥主體的藥動(dòng)學(xué)研究尚未見報(bào)道。本文建立了UPLC-PDA 方法測(cè)定當(dāng)歸石油醚萃取物中藁本內(nèi)酯血藥濃度，并對(duì)其大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLCTMPDA，美國(guó)Waters);Sartorius 電子分析天平(德國(guó)賽多利斯SARTORIUS 有限公司);高速冷凍離心機(jī)(TGL-6，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司);真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);微量移液器(200 μL，1 mL，Thermo);氮吹儀裝置(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 藥品與試劑

當(dāng)歸購(gòu)于山西省華陽(yáng)藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為正品，且留樣于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。藁本內(nèi)酯、內(nèi)標(biāo)異歐前胡素對(duì)照品(純度98%)均購(gòu)自上海順勃有限公司。

石油醚、95%乙醇、甲醇、乙腈、乙醚和異丙醇均為分析純，購(gòu)自北京化工試劑公司;純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自Fisher Scientific(USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠16 只，體重260 ±20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào):SCXK(京2006-0008)。將大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)7 d 適應(yīng)環(huán)境，每日觸摸動(dòng)物以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 當(dāng)歸石油醚萃取物的制備

取當(dāng)歸藥材適量，加8 倍量95%乙醇，回流提取3 次，第1、2 次每次2 h，第3 次1 h，合并回流液，過(guò)濾，回收乙醇至無(wú)醇味，加水分散，濃縮至浸膏(棕色粘稠液)，加入與浸膏等體積的石油醚，超聲提取(每次30 min)，至萃取液近乎無(wú)色時(shí)，合并石油醚萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收溶劑并濃縮至浸膏，于真空干燥箱(60℃)中干燥，即得(出膏率1.36%)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品約5.00 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得藁本內(nèi)酯0.497 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，并經(jīng)甲醇稀釋成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存于-20℃冰箱內(nèi)，備用。

2.3 灌胃液的制備

當(dāng)歸石油醚萃取物用調(diào)和食用油超聲溶解制得灌胃液，藁本內(nèi)酯濃度分別為3.768、1.884、0.942 mg/mL(按藁本內(nèi)酯含量折算)。

2.4 血清樣品的采集

SD 大鼠18 只，隨機(jī)分成3 組(即低劑量組、中劑量組、高劑量組)，每組6 只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。稱量大鼠體重，將當(dāng)歸石油醚萃取物灌胃液以10 mL/kg 的標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)三組灌胃給藥，并于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、5 和8 h 經(jīng)眼眶靜脈叢取血0.5 mL，靜置0.5 h 后，4000 rpm 離心10 min。移取上清液，-80 ℃冷藏待用。

2.5 血清樣品預(yù)處理

精密吸取血清200 μL，置10 mL EP 離心管中，依次加入濃度為1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)異歐前胡素50 μL，甲醇50 μL，萃取劑正己烷2 mL，渦旋混合3 min，3000 rpm 離心10 min，分取上層清液至另一10 mL EP 離心管中，下層殘?jiān)偌诱和? mL 萃取，合并兩次萃取液，常溫下N2流吹干，殘?jiān)尤?00 μL 甲醇超聲溶解3 min，渦旋混合2 min 后，轉(zhuǎn)移至0.5 mL EP 離心管中，于13000 rpm 離心5 min，取上清液，自動(dòng)進(jìn)樣分析。

包括固定資產(chǎn)貸款在運(yùn)營(yíng)期內(nèi)的年利息支出和流動(dòng)資金貸款利息支出。南水北調(diào)一期工程貸款償還期25年，按現(xiàn)行五年期以上貸款基準(zhǔn)利率6.55%計(jì)算。

2.6 色譜條件

色譜柱:BEH C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(0.03%三氟乙酸)(45∶55，v/v);流速:0.5 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性

取空白血清、空白血清加對(duì)照品、受試大鼠灌胃當(dāng)歸石油醚萃物0.25 h 后的血清樣品按“2.5”項(xiàng)處理，進(jìn)樣分析。所得代表色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，血漿樣品中藁本內(nèi)酯與內(nèi)標(biāo)異歐前胡素的保留時(shí)間分別為3.7 和4.9 min。經(jīng)過(guò)比較顯示血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)和待測(cè)物質(zhì)均無(wú)干擾，專屬性良好。

圖1 空白血清(A)、空白血清加對(duì)照品(B)及大鼠灌胃當(dāng)歸石油醚萃取物0.25 h 后血清樣品(C)的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of blank serum (A)，blank serum spiked with ligustilide andisoimperatorin standards (B)and serum sample after ig administration of petroleum ether extract of A.Sinensis at 0.25 h (C)

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

空白血清200 μL，分別加入50 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和50 μL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成含藁本內(nèi)酯濃度為9.144、4.572、1.828、0.914、0.457、0.183、0.091 μg/mL 的血清樣品，按“血清樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定，記錄色譜圖。以藁本內(nèi)酯峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(Y)對(duì)藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行加權(quán)最小二乘法線性回歸，所得回歸方程為:Y=1.161X-0.021(r2=0.9981)，線性范圍:0.091～9.144 μg/mL，線性良好。血清中藥物的最低檢測(cè)濃度(LLOQ)為0.091 μg/mL。

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度

取空白血清200 μL，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限”項(xiàng)下方法，分別制備藁本內(nèi)酯高、中、低3個(gè)濃度(濃度分別為7.315、0.914、0.183 μg/mL)的藁本內(nèi)酯血清質(zhì)控(QC)樣本，并測(cè)定高、中、低濃度的日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度;同法連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間RSD 與RE。數(shù)據(jù)均以“D”表示，結(jié)果符合方法學(xué)要求，高、中、低濃度的日內(nèi)和日間RSD 值與RE 值均＜10%，見表1。

表1 測(cè)定方法的精密度與準(zhǔn)確度(n=6)Table 1 Precision and accuracy of the developed UPLC method (n=6)

3.1.4 回收率實(shí)驗(yàn)

表2 測(cè)定方法的回收率(n=6)Table 2 Recovery of the developed UPLC method (n=6)

3.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制高、中、低3 種濃度7.315、0.914、0.183 μg/mL 的藁本內(nèi)酯血清質(zhì)控樣品各6 份，按如下3種方法處理后測(cè)定，(1)凍融循環(huán)穩(wěn)定性:反復(fù)凍融3 次后處理并測(cè)定;(2)短期穩(wěn)定性:將處理好的樣品于室溫下放置4 h 后測(cè)定;(3)長(zhǎng)期穩(wěn)定性:將“2.5 項(xiàng)”下所得殘?jiān)?20 ℃冷凍10 d 后測(cè)定。數(shù)據(jù)均以“D”表示，見表3。

表3 樣品穩(wěn)定性的測(cè)定(n=6)Table 3 Stability of sample (n=6)

3.2 藥動(dòng)學(xué)測(cè)定結(jié)果

將大鼠灌胃當(dāng)歸石油醚萃取物后血清樣品在上述方法下測(cè)定，將峰面積比值按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出藁本內(nèi)酯的血藥濃度，數(shù)據(jù)運(yùn)用DAS 3.0 進(jìn)行處理。結(jié)果表明低劑量組未檢測(cè)到，而高、中劑量組的藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)較符合二室模型，各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4，所有數(shù)據(jù)均以“D”表示。藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線見圖2。

表4 大鼠灌胃當(dāng)歸石油醚萃取物后藁本內(nèi)酯藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of ligustilide in rats after i.g.administration of petroleum ether extract of A.Sinensis (Oliv.)Diels

圖2 藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of ligustilide after i.g.administration of petroleum ether extract of A.Sinensis (Oliv.)Diels to rats (n=6)

4 討論

4.1 萃取劑的考察

分別考察了乙醚、正己烷、乙醚+10%HCl、正己烷+10%HCl 等4 種萃取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷萃取時(shí)的萃取效率最高，且不會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的干擾小，操作簡(jiǎn)單快速、成本低，且可以保證提取回收率和方法重現(xiàn)性，所以選擇該溶劑為血清樣品萃取劑。

4.2 流動(dòng)相的考察

本研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯在甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)中不能與內(nèi)源性物質(zhì)很好的分開，而選擇乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)能達(dá)到良好的分離效果。除此之外針對(duì)峰形稍微拖尾的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)分別考察了向水中加入0.03%三氟0.1%乙酸、0.1%甲酸，經(jīng)比較，前者效果良好，故最終確定乙腈-0.03%三氟乙酸水作為流動(dòng)相。

4.3 雙峰現(xiàn)象的推測(cè)

藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物藁本內(nèi)酯藥-時(shí)曲線呈雙峰現(xiàn)象，且第一峰高大于第二峰，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是受肝腸循環(huán)或不同腸斷吸收差異的影響，也可能是不規(guī)則胃排空導(dǎo)致。

4.4 藥動(dòng)結(jié)果的闡明

為了探討當(dāng)歸石油醚萃取物中藁本內(nèi)酯的在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特性，我們選取高、中、低三個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，低劑量組由于藁本內(nèi)酯的含量過(guò)低，吸收不明顯，受方法的靈敏度限制，含量已降至定量限下，無(wú)法進(jìn)行定量。而高、中劑量組藁本內(nèi)酯分別在0.20、0.19 h 達(dá)峰，t1/2β分別為4.08、3.06 h 左右，表明藁本內(nèi)酯具有吸收快，消除亦快，在體內(nèi)維持有效血藥濃度時(shí)間較短等特點(diǎn)。高、中劑量組的AUC 分別為0.95、0.61(μg/mL·h)，此結(jié)果與Chen YY［7］的研究結(jié)果較為一致。根據(jù)表觀分布容積參數(shù)V1/F 得知，其數(shù)值遠(yuǎn)大于大鼠體液體積0.67 L/kg，因此藁本內(nèi)酯同樣具有分布廣的特點(diǎn)。從高、中劑量組大鼠的參數(shù)及藥-時(shí)曲線可以看出，兩者吸收相當(dāng)，有可能是因?yàn)橹袆┝繒r(shí)藥物吸收已經(jīng)飽和，增加劑量并不能使生物利用度相應(yīng)的增加，表明當(dāng)歸中該成分為非劑量依賴型，此項(xiàng)結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，Ru Yan［9］在研究大鼠腹腔注射川芎藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，川芎中藁本內(nèi)酯呈劑量依賴型，造成如此差異的原因可能是所選給藥劑量區(qū)間有所差異或是不同藥材中其余化學(xué)成分的影響導(dǎo)致。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-PDA 法可靠、靈敏，能夠快速、準(zhǔn)確的測(cè)定藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，所得藥動(dòng)學(xué)結(jié)果，可為臨床合理用藥提供一定基礎(chǔ)。

1 Chan SK，Cheng TY，Lin G.Relaxation effects of ligustilide and senkyunolide A，two main constituents of Ligusticum chuanxiong，in rat isolated aorta.J Ethnopharmacol，2007，111:677-680.

2 Kuang X，Yao Y，Du JR，et al.Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICR mice.Brain Res，2006，1102:145-153.

3 Kuang X，Du JR，Liu YX，et al.Postischemic administration of Z-ligustilide ameliorates cognitive dysfunction and brain damage induced by permanent forebrain ischemia in rats.Pharmacol Biochem Behav，2008，88:213-221.

4 Guo JM，Shang EX，Duan JA，et al.Determination of ligustilide in the brains of freely moving rats using microdialysis coupled with ultra performance liquid chromatography/ mass spectrometry.Fitoterapia，2011，82:441-445.

5 Ren YL(任艷玲).Studies on chemical composition and quality control of antidepressant fractions from Xiaoyaosan.Taiyuan:Shanxi University(山西大學(xué))，MSc.2012.

6 Cui J(崔杰).Preliminary study on pharmacokinetics of antidepressant effective fraction from xiaoyaosan based on serum pharmacochemistry.Taiyuan:Shanxi University (山西大學(xué))，MSc.2012.

7 Chen YY(陳欲云)，Yu Y(余彥)，Chen C(陳雛)，et al.Pharmacokinetic profile of Z-ligustilide in rat plasma and brain following oral administration.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2010，22:126-131.

8 Liu Y(劉洋)，Hu LD(胡連棟)，Tang X(唐星)，et al.Pharmacokinetics of ligustilide in Ligusticum chuanxiong essential oil in rats in vivo.Chin Tradit Herbal Drugs(中草藥)，2009，40:228-230.

9 Ru Y.Pharmacokinetics and metabolism of ligustilide.Drug Metab Dispos，2007，36:400-408.