高效液相色譜法測定甜菊糖苷中甜菊醇的含量

胡 林，寇彥杰，翁永京，萬小玲

1四川泰華堂制藥有限公司，廣漢 618300;2 成都華高藥業(yè)有限公司，成都 610059

甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)為菊科(Composital)斯臺比亞屬(Stevia)多年生草本植物。甜菊糖苷(steviol glycosides，SGs)是一種從甜葉菊的葉和莖中提取出來的高甜度、低熱量天然甜味劑，它主要含九種不同甜味成分［1］，其中甜菊苷(Stevioside)為主要成分，甜菊醇(Steviol)為甜菊苷的苷元，分子具有對映貝殼杉烯型四環(huán)二萜骨架結(jié)構(gòu)，具有廣泛的生理活性，如清熱解毒、抗菌消炎、抗腫瘤等作用［3，4］。本方法采用高效液相色譜法測定甜菊糖苷中甜菊醇的含量，為甜菊糖苷產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)檢測依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(配備在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器);CP225D 型電子分析天平(Sartorius 公司);DHG-9140 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;KQ-250B 型超聲波清洗器。

1.2 材料

甜菊醇對照品(含量100.0%)購自美國ChromaDex 公司;甜菊糖苷樣品由成都華高藥業(yè)有限公司提供;乙腈(色譜純)購自美國Sigma-Aldrich 公司;乙醇(分析純)購自廣東光華科技股份有限公司;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18(4.6 ×250 mm 5 μm;流動相:乙腈-水(50∶50);流速:1.0 mL/min;檢測波長:213 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 對照品貯備溶液的制備

精密稱取甜菊醇對照品約5.0 mg，置100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備溶液(每1 mL 含甜菊醇50.0 μg)。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密量取甜菊醇對照品貯備溶液適量，加50%乙醇溶液制成1 mL 約含1.0、5.0、12.5、25.0 和50.0 μg 的溶液，即得五個濃度對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取甜菊糖苷約1.0 g，置10 mL 容量瓶中，加50%乙醇溶液約8 mL，超聲溶解15 min，放冷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 測定方法

將“2.2”和“2.3”項下制得的對照品溶液和供試品溶液在高效液相色譜儀上按“2.1”項下測定，記錄圖譜中甜菊醇的峰面積，見圖1。

圖1 甜菊醇對照品溶液(A)和甜菊糖苷供試品溶液(B)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of steviol standard (A)and steviol glycosides (B)

2.5 計算

將“2.4”項下記錄甜菊醇對照品的峰面積為橫坐標(biāo)x 軸，以溶液濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)y 軸，繪制甜菊醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程y=bx。樣品中甜菊醇百分含量按以下公式計算:

式中:%X 為樣品中甜菊醇百分含量，A 為樣品溶液的甜菊醇峰面積，V 為樣品稀釋體積10 mL，W為樣品的重量g。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

甜菊醇在1.046～52.3 μg/mL 濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.1795x，相關(guān)系數(shù)為0.9997。

2.6.2 精密度試驗

取同一批供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，每次進樣10 μL，記錄甜菊醇色譜峰面積，計算峰面積的RSD為0.75%，結(jié)果表明儀器的精密度高。

2.6.3 重復(fù)性試驗

取同一批甜菊糖苷樣品6 份，按“2.3”項下“供試品溶液的制備”方法制備并測定，結(jié)果甜菊醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.25%，相對保留時間的RSD 為0.35%，結(jié)果表明方法重復(fù)性好。

2.6.4 加標(biāo)回收率試驗

取已知含量的甜菊糖苷樣品，精密稱定6 份，分別加入甜菊醇對照品約150.0 μg，按“2.3”項下“供試品溶液的制備”方法制備并測定，結(jié)果加標(biāo)平均回收率為96.60%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.51%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，見表1。

表1 回收率試驗Table 1 Results of recovery tests (n=6)

2.7 樣品測定

按上述條件下測定不同等級［2］甜菊糖苷樣品中甜菊醇的含量，結(jié)果見表2

表2 不同等級甜菊糖苷樣品中甜菊醇的含量Table 2 Content of steviol in the different grades of steviol glycosides

3 討論

在供試品制備過程中分別采用甲醇、乙醇和水的單一溶劑及不同比例混合溶劑作為提取溶劑進行試驗，結(jié)果表明50%乙醇水溶液提取效果最佳。對超聲提取時間進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 min 后甜菊醇已經(jīng)提取完全，考慮到節(jié)省樣品處理時間，確定提取時間為15 min。對不同等級甜菊糖苷樣品中甜菊醇的含量測定結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn):樣品中甜菊糖苷含量越高甜菊醇含量就越低，表明甜菊糖苷樣品經(jīng)過反復(fù)純化后甜菊醇所占比重降低。迄今為止簡單快速、準(zhǔn)確定量檢測甜菊糖苷中甜菊醇含量的方法國內(nèi)尚未見報道，本文為甜菊糖苷中甜菊醇含量測定建立了一種可靠的方法。

1 Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.Specification of steviol glycosides.published in FAO JECFA，2010，Monographs 10.

2 The Peoples’Republic of China National Standard GB 8270-1999(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).Food Additives，Stevioside(食品添加劑，甜菊糖苷).State Quality and Technical Supervision，1999.

3 Hu YQ(胡艷秋)，Shi H(石浩).Research progress of steviol and its derivatives.Zhejiang Chem Ind(浙江化工)，2011，42:10-14.

4 Mao JL(毛近隆).The progress of steviol in chemical structure modification.J Beijing Union Univ，Nat Sci(北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報，自科版)，2011，25:70-74.