擬諾卡氏放線菌YIM 90087 的代謝產(chǎn)物研究

徐 偉，丁章貴，李銘剛，文孟良，趙江源*

1云南大學(xué)云南省微生物研究所，昆明 650091;2 安徽省應(yīng)用技術(shù)研究院，合肥 230031

擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis，Meyer 1976 年提出［1］)微生物是一類高G +C 含量革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，廣泛分布于各種環(huán)境中，尤其在中度和高度鹽環(huán)境中呈優(yōu)勢(shì)微生物群落。擬諾卡氏屬目前已有個(gè)49個(gè)有效描述種［2］。人們對(duì)從各種環(huán)境中分離的擬諾卡氏菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，通過(guò)發(fā)酵分離出很多結(jié)構(gòu)類型豐富的化合物。Apoptolidins A-G［3-7］、K-252 a-d［8，9］、Lucentamycin A-E［10，11］、Nocapyrones A-G［12，13］、Nocardioazine A-B［14］、Nocazines A-C、Nocazoline A［13］、Nocardiopsin A-B［15］、Naphthospironone A［16］和Griseusins F-G［17］等一系列結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)為創(chuàng)新藥物研究提供了豐富的來(lái)源。

本文通過(guò)對(duì)35 株擬諾卡放線菌發(fā)酵提取物的TLC 化學(xué)多樣性進(jìn)行篩選，最終將TLC 條帶最為豐富的菌株YIM90087 確定為研究菌株。該菌株是2004 年由李文均等人從中國(guó)新疆高鹽土壤中分離出來(lái)的一株擬諾卡放線菌，并鑒定為Nocardiopsis gilva sp.nov.［18］。通過(guò)對(duì)其固體發(fā)酵提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中共分離得到10個(gè)化合物，這些化合物的結(jié)構(gòu)類型主要為環(huán)肽類化合物，其中化合物5 為2013 年發(fā)表的一個(gè)新的三聯(lián)苯類化合物，化合物4 僅見(jiàn)化學(xué)合成報(bào)道，作為天然產(chǎn)物未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AM-400 型核磁共振儀;Bruker DRX-500型核磁共振儀;Agilent G3250AA LC/MSD TOF 型質(zhì)譜儀;薄層層析硅膠板和柱層析硅膠G，200～300目(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(Amersham Pharmacia);Waters 高效液相色譜儀(515-2996);島津制備型高效液相色譜儀(LC-8A);其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 發(fā)酵菌株

菌株YIM90087 由云南省微生物研究所唐蜀昆老師提供，該菌種于2004 年由云南省微生物研究所李文均等人鑒定為擬諾卡氏菌屬的一個(gè)新種(Nocardiopsis gilva sp.nov.)，菌株保存于云南省微生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基:淀粉20 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏2 g/L，KNO32 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，1% NaCl。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，CaCl2·2H2O 0.74 g/L，1% NaCl。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，CaCl2·2H2O 0.74 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH=10，5% NaCl。

種子液制備:從新鮮斜面培養(yǎng)中將菌株轉(zhuǎn)接到裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，于35℃、200 rpm 搖床培養(yǎng)4 d。

將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基平板中，每個(gè)平板裝25 mL 培養(yǎng)基，共發(fā)酵1500個(gè)平板，35 ℃培養(yǎng)14 d。

1.4 提取與分離

將發(fā)酵好的固體培養(yǎng)基劃成小塊、粉碎，放于錐形瓶中用等體積丙酮超聲提取3 次，所得提取液經(jīng)減壓濃縮至浸膏，將浸膏懸浮于蒸餾水后加入等體積乙酸乙酯萃取至無(wú)色，將乙酸乙酯減壓濃縮，最后得到發(fā)酵粗提物39.9 g。發(fā)酵粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度(100∶0、60∶1、40∶1、20∶1、9∶1、1∶1，V/V)洗脫，共得到9個(gè)組分(S1～S9)。S2 用石油醚-丙酮(10∶1)柱層析得到化合物5(15 mg)和6(8 mg)。S3 經(jīng)凝膠Sephadex LH-20 柱層析，用甲醇洗脫得化合物1(8 mg)、2(6 mg)和3(5 mg)。S4經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-丙酮(8∶1)洗脫得化合物4(9 mg)、7(7 mg)和8(5 mg)。S7 經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-丙酮(9∶1)洗脫再經(jīng)C18 反相柱層析，用甲醇-水(5 ∶95)洗脫得化合物9(8 mg)，剩余再經(jīng)HPLC 制備，用甲醇-水(10∶90)洗脫得化合物10(9 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～10 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-10

化合物1 無(wú)色針晶(甲醇);mp.267～269 ℃;分子式為C11H12N2O2;ESI-MS m/z:227 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.92 (1H，br s，1-NH)，4.06 (1H，m，H-3)，8.19 (1H，br s，4-NH)，3.33-2.72 (2H，d，J=17.4 Hz，H-6)，3.09～2.88 (2H，dd，J=13.4，4.2 Hz，H-7)，7.16 (2H，d，J=5.7 Hz，H-9，13)，7.27 (2H，m，H-10，12)，7.26(1H，m，H-11);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:167.4 (C-2)，55.6 (C-3)，165.9 (C-5)，43.7 (C-6)，38.9 (C-7)，136.0 (C-8)，130.2 (C-9，13)，128.3 (C-10，12)，126.9 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［19］一致，確定化合物1 為(3S)-3-芐基-2，5-哌嗪二酮。

化合物2 白色粉末;mp.265～266 ℃;分子式為C10H18N2O3;ESI-MS m/z:237 ［M+Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.89 (1H，br s，1-NH)，3.57 (1H，m，H-3)，8.08 (1H，br s，4-NH)，3.56(1H，m，H-6)，1.87 (1H，m，H-7)，1.50-1.10 (2H，m，H-8)，0.80 (3H，m，H-9)，0.90 (3H，d，J=6.8 Hz，H-10)，3.97 (1H，m，H-11)，4.86 (1H，br s，11-OH)，1.09 (3H，d，J=6.5 Hz，H-12);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:167.3 (C-2)，58.9 (C-3)，166.9 (C-5)，60.1 (C-6)，38.8(C-7)，24.6(C-8)，11.7(C-9)，15.4(C-10)，66.8(C-11)，20.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［20］基本一致，確定化合物2 為(3S，6S)-3-(2-丁基)-6-(1-羥乙基)-2，5-哌嗪二酮。

化合物3 白色針晶(甲醇);mp.236～238 ℃;分子式為 C9H16N2O3;ESI-MS m/z:223 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.93 (1H，br s，1-NH)，3.69 (1H，m，H-3)，8.04 (1H，br s，4-NH)，3.79 (1H，m，H-6)，1.85 (1H，m，H-7)，1.46-1.14 (2H，m，H-8)，0.82 (3H，m，H-9)，0.91 (3H，d，J=6.8 Hz，H-10)，3.65-3.57 (2H，dd，J=10.9，2.8 Hz，H-11);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:166.7(C-2)，58.8 (C-3)，166.2 (C-5)，56.8 (C-6)，38.5(C-7)，24.3 (C-8)，11.8 (C-9)，15.1 (C-10)，62.5(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［21］基本一致，確定化合物3 為(3S，6S)-3-(2-丁基)-6-羥甲基-2，5-哌嗪二酮。

化合物4 白色針晶(甲醇);mp.90～92 ℃;［α］21D-24.5 (c 9.0，DMF);分子式為C10H9NO3;ESIMS m/z:214 ［M+Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:4.32 (1H，m，H-3)，7.93 (1H，br s，4-NH)，2.92 (2H，s，H-6)，7.17 (2H，d，J=7.2 Hz，H-8，12)，7.26 (2H，m，H-9，11)，7.21 (1H，m，H-10);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:175.4 (C-2)，58.5(C-3)，157.4 (C-5)，36.5 (C-6)，135.7 (C-7)，129.9 (C-8，12)，128.2 (C-9，11)，126.8 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［22］基本一致，確定化合物4 為(4S)-4-芐基-1，3-惡唑-2，5-二酮。

化合物5 白色針晶(甲醇);分子式為C22H22O5;ESI-MS m/z:389 ［M +Na］+;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.37 (1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，7.06(1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，3.88 (3H，s，H-7)，6.76 (1H，s，H-5')，3.69 (3H，s，H-7')，3.61 (3H，s，H-8')，7.55 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2''，6'')，6.99(2H，d，J=8.6 Hz，H-3''，5'')，3.87 (3H，s，H-7'');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:124.4 (C-1)，131.5 (C-2，6)，114.6 (C-3，5)，159.4 (C-4)，55.3(C-7)，121.4 (C-1')，151.4 (C-2')，144.2 (C-3')，135.4 (C-4')，111.4 (C-5')，149.1 (C-6')，60.8(C-7')，，60.7 (C-8')，130.3 (C-1'')，130.2 (C-2''，6'')，113.6 (C-3''，5'')，158.9 (C-4'')，55.3(C-7'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［23］一致，確定化合物5 為6'-羥基-4，2'，3'，4''-四甲氧基-對(duì)三聯(lián)苯。

化合物6 白色針晶(甲醇);mp.293～295 ℃;分子式為C15H20N2O3;ESI-MS m/z:299 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:9.15 (1H，br s，1-NH)，4.66 (1H，m，H-3)，9.27 (1H，br s，4-NH)，4.18 (1H，m，H-6)，3.57～3.24 (2H，dd，J=13.6，5.3 Hz，H-7)，7.38 (2H，d，J=8.4 Hz，H-9，13)，7.11 (2H，d，J=8.4 Hz，H-10，12)，11.40(1H，br s，11-OH)，1.65-0.97 (2H，m，H-14)，1.96(1H，m，H-15)，0.92 (3H，d，J=6.6 Hz，H-16)，0.90 (3H，d，J=6.6 Hz，H-17);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:169.5 (C-2)，57.7 (C-3)，168.2 (C-5)，54.3 (C-6)，40.4 (C-7)，127.7 (C-8)，132.5(C-9，13)，116.8 (C-10，12)，158.7 (C-11)，45.3(C-14)，24.9 (C-15)，23.7 (C-16)，21.8 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［24］基本一致，確定化合物6 為(3S，6S)-3-(4-羥芐基)-6-異丁基-2，5-哌嗪二酮。

化合物7 白色針晶(甲醇);mp.148～150 ℃;分子式為C10H16N2O2;ESI-MS m/z:219 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:5.76 (1H，br s，2-NH)，3.97 (1H，m，H-3)，3.63 (2H，m，H-6)，2.07-1.92 (2H，m，H-7)，2.41-2.05 (2H，m，H-8)，4.11 (1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，2.66 (1H，m，H-10)，1.09 (3H，d，J=7.7 Hz，H-11)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，H-12);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:169.9 (C-1)，60.5 (C-3)，165.1 (C-4)，45.2 (C-6)，22.4 (C-7)，28.3 (C-8)，58.9 (C-9)，28.5 (C-10)，19.5 (C-11)，16.1 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［25］基本一致，確定化合物7 為(3R，8aS)-3-異丙基-六氫吡咯并［1，2-a］吡嗪-1，4-二酮。

化合物8 白色針晶(甲醇);mp.230～232 ℃;分子式為 C9H16N2O2;ESI-MS m/z:207 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:8.11 (1H，br s，1-NH)，3.76 (1H，m，H-3)，8.14 (1H，br s，4-NH)，3.86 (1H，dd，J=6.7，2.3Hz，H-6)，1.60～1.46 (2H，m，H-7)，1.81 (1H，m，H-8)，0.86 (3H，d，J=6.7 Hz，H-9)，0.88 (3H，d，J=6.7 Hz，H-10)，1.26 (3H，d，J=6.7 Hz，H-11);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:168.4 (C-2)，52.6 (C-3)，168.9 (C-5)，49.9 (C-6)，42.6 (C-7)，23.6 (C-8)，21.9 (C-9)，23.0 (C-10)，19.6 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［26］一致，確定化合物8 為(3S，6S)-3-異丁基-6-甲基-2，5-哌嗪二酮。

化合物9 白色針晶(甲醇);分子式為C13H16N2O3;ESI-MS m/z:271 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.88 (1H，br s，1-NH)，4.08 (1H，m，H-3)，8.20 (1H，br s，4-NH)，3.92 (1H，d，J=3.8 Hz，H-6)，2.93-2.71 (2H，dd，J=7.6，2.6 Hz，H-7)，7.23 (2H，d，J=7.4 Hz，H-9，13)，7.26 (2H，m，H-10，12)，7.21 (1H，m，H-11)，3.35 (1H，m，H-14)，1.08 (3H，d，J=6.5 Hz，H-15);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:167.4 (C-2)，56.6 (C-3)，169.1 (C-5)，60.9 (C-6)，39.3 (C-7)，136.9 (C-8)，130.3 (C-9，13)，128.2 (C-10，12)，126.7 (C-11)，72.6 (C-14)，19.6 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［27］基本一致，確定化合物9 為(3S，6S)-3-芐基-6-(1-羥乙基)-2，5-哌嗪二酮。

化合物10 白色針晶(甲醇);分子式為C14H18N2O3;ESI-MS m/z:285 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.79 (1H，br s，1-NH)，4.06 (1H，m，H-3)，8.13 (1H，br s，4-NH)，3.78 (1H，d，J=3.7 Hz，H-6)，2.90-2.69 (2H，dd，J=7.6，2.5 Hz，H-7)，7.22 (2H，d，J=7.4 Hz，H-9，13)，7.25 (2H，m，H-10，12)，7.19 (1H，m，H-11)，3.93 (1H，m，H-14)，1.55-1.32 (2H，m，H-15)，0.95 (3H，t，J=7.4 Hz，H-16);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:167.6(C-2)，56.9 (C-3)，168.3 (C-5)，59.3 (C-6)，39.5(C-7)，136.8 (C-8)，130.2 (C-9，13)，128.1 (C-10，12)，126.6 (C-11)，73.7 (C-14)，26.1 (C-15)，11.3 (C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［27］基本一致，從而確定化合物10 為(3S，6S)-3-芐基-6-(1-羥丙基)-2，5-哌嗪二酮。

3 討論

本研究從35 株擬諾卡放線菌中通過(guò)對(duì)菌株發(fā)酵提取物的TLC 化學(xué)多樣性進(jìn)行篩選，最終確定了YIM90087 為研究菌株，在對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)擬諾卡放線菌對(duì)培養(yǎng)基要求較高，且擬諾卡放線菌生長(zhǎng)緩慢，由于我們對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化不夠全面，導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)物總量較少，這樣某些含量較低、成分復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，不能得到有效的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，今后還需對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行更為全面的優(yōu)化，并對(duì)其中的微量成分進(jìn)一步深入研究。

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