快速溶劑萃取提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷工藝的響應面優(yōu)化

曹靜亞，遲曉峰，陳 濤，董 琦，譚 亮，胡風祖*

1中國科學院藏藥研究重點實驗室;2 中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008

何首烏為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根，其性微溫，味苦、甘、澀。何首烏在臨床應用上有“生首烏”和“制首烏”之別，前者功能解毒、消癰、潤腸通便，后者補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨［1］。

何首烏主要含有蒽醌類、芪類和卵磷脂三大類成分，其中芪類化合物中的白藜蘆醇具有明顯的抗氧化、抗腫瘤生物活性［2，3］。白藜蘆醇在自然條件下以自由態(tài)和糖苷兩種形式存在。對白藜蘆醇苷的提取通常采用加熱回流的方法，張建超［4］等人對虎杖中白藜蘆醇苷的提取分離工藝進行了研究，得到醇提工藝的最優(yōu)條件為:95%乙醇回流提取3 次，每次2 h。該種方法操作復雜，耗時長。而白藜蘆醇具有熱敏性，回流提取時間長時，原料長時間受熱，在提取過程中易遭到破壞［5］。

ASE 是指在密閉容器內(nèi)于高溫(50～200 ℃)和高壓(500～3000 psi)條件下，在短時間內(nèi)，用有機溶劑提取固體或半固體樣品的一種新型樣品前處理方法［6］。與超聲、微波、回流、超臨界萃取等成熟方法相比，ASE 有有機溶劑用量少、提取時間短、萃取效率高、操作簡單方便、安全和自動化程度高等優(yōu)點［7］。因此本研究選用快速溶劑萃取法(ASE)對何首烏中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷進行提取，并采用響應面分析法得到了ASE 提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷最優(yōu)的工藝參數(shù)，為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取開發(fā)利用提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本實驗中栽培何首烏材料由青海西寧市廿里鋪蓓蕾花木有限公司提供，樣品經(jīng)陰干，粉碎后，過孔徑0.175 mm 篩，冷藏保存;白藜蘆醇(批號:111535-200502)購自中國藥品生物制品檢定所，白藜蘆醇苷(批號:H-012-110420)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈(色譜純)山東禹王;自制超純水;其余試劑均為分析純。

ASE350 快速溶劑萃取儀(美國DIONEX 公司);Agilent1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱Agilent Eclipse-XDB C18(5 μm，250 ×4.6 mm);MOLELEMENT 元素型超純水機(上海摩勒生物科技有限公司);METTLER TOLEDO PL203 和XS204 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC 檢測條件

色譜柱:Agilent Eclipse-XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相∶V(乙腈)∶V(水)=23∶77;流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長306 nm。

1.2.2 不同提取方法的考察

1.2.2.1 超聲提取法

準確稱取0.1 g 何首烏樣品，置于三角瓶中，精密加入50%的乙醇溶液25 mL，置于超聲波清洗器中提取一次，提取時間40 min，提取功率500 W。提取液過濾后，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進液相進行分析。

1.2.2.2 加熱回流法

準確稱取0.1 g 何首烏樣品，置于磨口三角瓶中，精密加入50%的乙醇溶液25 mL，稱重，于70 ℃下回流提取40 min，用提取溶劑補重。提取液過濾后，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進液相進行分析。

1.2.2.3 ASE 法

準確稱取0.2 g 何首烏樣品，置于34 mL 不銹鋼萃取池中，以50%的乙醇溶液為提取溶劑，提取一次，提取時間10 min，提取溫度70 ℃。用提取溶劑將提取液定容至100 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進液相進行分析。

1.2.3 標準曲線的繪制

精密稱取對照品白藜蘆醇0.128 mg 和白藜蘆醇苷1.63 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用50%的乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。配置成濃度分別為12.8 μg/mL 和163 μg/mL 的對照品溶液。吸取以上對照品溶液1.00、2.00、6.00、8.00、10.00 μL，注入高效液相色譜儀進行檢測，擬合峰面積(y)和進樣量(x，μg)作回歸曲線。

1.2.4 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率計算

按上述方法吸取10 μL 供試品溶液注入高效液相色譜儀，重復進樣三次，峰面積取平均值。將峰面積平均值代入回歸方程，即可求出供試品溶液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量C，帶入下式計算白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取率。

E(mg/g)=(C×V)/(I×W)

式中:C 為回歸方程求出的樣品溶液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量(μg);V 為定容體積(mL);I為進樣量(μL);W 為樣品處理前干重(g)。

1.2.5 響應面法提取工藝試驗設計

根據(jù)前期試驗篩選，本實驗主要考察乙醇濃度(%)、提取時間(min)和提取溫度(℃)3 個因素對響應值白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率的影響，首先進行單因素試驗。通過單因素預實驗，應用Design-Expert 7.0.0 軟件，設計3 因素3 水平的響應面試驗。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的測定

按照“1.2.1”色譜條件，測得白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照品與何首烏樣品的液相色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(a)及樣品(b)的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of the mixed standards (a)and the sample (b)(1:polydatin;2:resveratrol);(1:白藜蘆醇苷;2:白藜蘆醇)

2.2 線性關系

依據(jù)“1.2.3”項下標準曲線繪制方法，得回歸方程:(1)白藜蘆醇Y=6284.61X-1.69，R2=0.9999，在0.0128～0.128 μg 范圍內(nèi)成良好的線性關系;(2)白藜蘆醇苷Y=3964.13X-8.57，R2=0.9999，在0.163～1.63 μg 范圍內(nèi)成良好的線性關系。

2.3 不同提取方法的比較

由實驗得出，三種不同的提取方法得到白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總含量(n=5)分別為:超聲提取法(21.27 ±0.37)mg/g，加熱回流法(23.69 ±0.45)mg/g，ASE 法(25.43 ±0.41)mg/g。對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總含量的影響由高到低順序為:ASE ＞加熱回流法＞超聲提取法。其中，ASE 作為一種新的提取方法提取效果最好，提取時間少，而且不需要過濾步驟，避免了過濾過程中的損失。所以本實驗進一步對ASE 提取何首烏中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的條件進行優(yōu)化。

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 循環(huán)次數(shù)對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度在50%，提取溫度70 ℃，提取時間10 min)，考察循環(huán)次數(shù)分別為1、2、3 的條件下，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在循環(huán)次數(shù)為1、2 次時，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率幾乎不變，當循環(huán)3 次時，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率下降。因此，循環(huán)次數(shù)選為1 次。

2.4.2 乙醇濃度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(提取溫度70 ℃，提取時間10 min，循環(huán)1 次)，考察乙醇濃度分別為0%、30%、50%、70%、100%的條件下，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在乙醇濃度為0%～50%范圍內(nèi)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨乙醇濃度的升高而增加，但當乙醇濃度大于50%時，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨乙醇濃度的升高而減小。因此，考慮到得率和成本，乙醇濃度選擇50%左右為宜。

2.4.3 提取溫度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度50%，提取時間10 min，循環(huán)1 次)，考察提取溫度分別為25、50、70、90、110 ℃的條件下白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，提取溫度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率有很大的影響，在25～90 ℃范圍內(nèi)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨溫度的升高而增加，超過90 ℃后提取率幾乎不再增加，因此，提取溫度以90 ℃左右為宜。

2.4.4 提取時間對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度50%，提取溫度90 ℃，循環(huán)1 次)，考察提取時間分別為1、5、15、25、35、45 min 條件下白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在1～15 min 范圍內(nèi)白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨提取時間的升高而增加，超過15 min 后提取率隨提取時間而緩慢下降，可能是時間過長導致白藜蘆醇和白藜蘆醇苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，因此提取時間以15 min 左右為宜。

2.5 響應面法優(yōu)化白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝

2.5.1 模型方差分析

對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝條件的優(yōu)化試驗設計及結(jié)果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

綜合考慮單因素試驗結(jié)果，利用Design-expert 7.0.0 統(tǒng)計軟件對響應面試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到多元二次回歸方程模型:

式中E 為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取率(mg/g);A 為乙醇濃度(%);B 為提取溫度(℃);C為提取時間(min)。

對該回歸方程進行方差分析見表3，可以看出，回歸模型(P ＜0.0001)極顯著，相關系數(shù)R2=0.998，失擬項(P=0.9695 ＞0.05)，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，因此，該模型對試驗的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該模型對實驗參數(shù)進行分析。由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內(nèi)，3 個因素對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取得率影響的順序為提取溫度(B)＞提取時間(C)＞乙醇濃度(A)。二次項A2、B2和C2影響極顯著，交互項AB、BC 達到極顯著水平，AC 顯著，表明各因素對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響不是簡單線性關系。

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 ANOVA of regression analysis

2.5.2 響應面分析

乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)3個因素之間的交互作用對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率的影響如圖2～4 所示。

圖2 E=f(A，B)的響應面(a)及等高線圖(b)Fig.2 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (A，B)

圖3 E=f(A，C)的響應面(a)及等高線圖(b)Fig.3 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (A，C)

圖4 E=f(B，C)的響應面(a)及等高線圖(b)Fig.4 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (B，C)

分析圖2a～4a 可知，當乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)取值較小時，效應面曲線較陡，說明此時A、B、C 對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率影響較為顯著，但當A、B、C 取值較大時，效應面曲線較平緩，此時A、B、C 對E 影響較小。

分析圖2b～4b 可知，當A、B、C 取值較小時，等高線密度大;當A、B、C 取值較大時，等高線密度較小，說明A、B、C 取值小時，對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率影響較為顯著，與響應面規(guī)律相同。同時，三個等高線圖均呈明顯的橢圓形，說明乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)三因素之間的交互作用均顯著，與方差分析結(jié)果一致。

經(jīng)過Box-Behnken 設計優(yōu)化提取條件，得到最佳的提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度51%，提取溫度96℃，提取時間16 min，此時白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率理論值可達到40.60 mg/g。

2.5.3 驗證實驗

在此最佳工藝條件下，進行3 次平行提取，測得白藜蘆醇和白藜蘆醇苷平均總提取率為40.43 mg/g。表明預測值與實際值之間具有很好的擬合性，從而進一步證明響應面結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)論

本研究采用3 種提取方法提取青海栽培何首烏中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，結(jié)果ASE 的提取效果最佳。利用響應面法優(yōu)化了ASE 的提取工藝條件，優(yōu)化的最佳組合條件為:乙醇濃度51%，提取溫度96℃、提取時間16 min。實驗結(jié)果表明:響應面模型擬合程度高，實驗誤差小，具有實際應用價值，為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取開發(fā)利用提供了技術支撐。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol Ⅰ，164.

2 Jang M，Cai L，Udeani GO，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a nature product derived from grapes.Science，1997，275:218-220.

3 Wang Z(王征)，Luo ZM(羅澤民)，Deng LW(鄧林偉).The pharmacologic mechanism and synthesis of resveratrol.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2003，15:178-181.

4 Zhang JC(張建超)，Gao XZ(高新周)，Yi DL(易德亮).Study on extraction process of polydatin in Polygonum cuspidatum.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2003，14(4):3-4.

5 Chen YB(陳易彬)，Chen K(陳奎).Study on extraction of resveratrol.Food Sci(食品科學)，2007，28:197-199.

6 Richter BE，Jones BA，Ezzell JL，et al.Accelerated solvent extraction:a technique for sample preparation.Anal Chem，1996，68:1033-1039.

7 Mou SF(牟世芬)，Liu YJ(劉勇建).The principle and application of accelerated solvent extraction.Mod Sci Inst (現(xiàn)代科學儀器)，2001，3:18-20.