星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化紅梅消總皂苷雙水相提取工藝

勵(lì) 娜，周文杰，2，禹奇男，2，楊榮平，2*

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137

紅梅消為薔薇科懸鉤子屬植物紅梅消Rubus parvifolius L.的干燥全草，具有清熱涼血、止血散結(jié)、止痛利尿消腫等功效，是一味常見的，在民間有著悠久應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)中藥，民間多以茅莓、五月紅、草楊梅等別名沿用。早在唐《本草拾遺》中就有紅梅消能“止血活血、散瘀定痛、清熱解毒之功效，可內(nèi)服、外敷”的記載;現(xiàn)代藥理研究表明，紅梅消的主要有效成分皂苷類物質(zhì)具有顯著的保護(hù)神經(jīng)元，抗腫瘤，抗腦缺血［1-3］等作用。因紅梅消易獲得、種植與加工成本低廉、且其臨床療效顯著，故研究紅梅消總皂苷的提取技術(shù)在心腦血管類疾病的新藥研制方面有著極大的開發(fā)空間及市場需求，也勢必會(huì)帶來良好的經(jīng)濟(jì)和市場效應(yīng)。

傳統(tǒng)的提取技術(shù)在紅梅消總皂苷的提取純化上存在提取率較低，純化工藝復(fù)雜等弊端，故筆者將數(shù)學(xué)模型與現(xiàn)代新型提取分離技術(shù)相結(jié)合，對紅梅消總皂苷的提取進(jìn)行了優(yōu)化研究。本試驗(yàn)首次將超聲提取技術(shù)耦合乙醇-硫酸銨雙水相萃取分離技術(shù)應(yīng)用到紅梅消的提取工藝中:在常溫條件下，以紅梅消總皂苷的得率為指標(biāo)，依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)要求和雙水相圖特點(diǎn)，首次采用先依據(jù)雙水相圖確定中心點(diǎn)并縮小因素取值范圍，使因素水平滿足雙水相的條件要求后，再應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到提取紅梅消總皂苷的最優(yōu)方法。上述改進(jìn)，使實(shí)驗(yàn)更有理據(jù)，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠且符合實(shí)際。雙水相提取紅梅消總皂苷法為其后續(xù)開發(fā)以紅梅消總皂苷為主要原料的新藥研制奠定了一定的工作基礎(chǔ)，同時(shí)也為雙水相提取技術(shù)在中藥材提取上的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

UV2800PC 紫外可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，AEG-45SM 電子天平(日本島津公司)，BS110 S 電子天平(德國Sartorius 公司)，KQ-50B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

紅梅消藥材經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云研究員鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物紅梅消Rubus parviflolius L.的干燥全草。齊墩果酸對照品(由南通飛宇生物科技有限公司提供，批號:FY15170920，含量≥98%);其試劑均為分析純，由重慶川東化學(xué)試劑有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乙醇—硫酸銨雙水相體系的建立

雙水相體系的形成主要受有機(jī)溶劑和鹽的質(zhì)量百分比影響，整個(gè)雙水相體系性質(zhì)隨著上述兩個(gè)值的變化而改變，出現(xiàn)單相、雙水相、固-液三相、固-液兩相四種不同的狀態(tài)。而濁點(diǎn)曲線和鹽析曲線即為雙水相體系中不同狀態(tài)的分界線。

2.1.1 濁點(diǎn)曲線(單相區(qū)與雙水相相區(qū)的分界線［4］)的測定

加入定量的硫酸銨于50 mL 燒杯中，再加5 mL蒸餾水充分溶解，靜置15 min 至溶液澄清，容器底部無固體存在，用無水乙醇滴定至溶液剛好渾濁，攪拌均勻，靜置15 min 后，體系出現(xiàn)分層現(xiàn)象，反復(fù)攪拌分層現(xiàn)象不消失，記錄此點(diǎn)各組分的加入量，該點(diǎn)即為雙水相濁點(diǎn)的液-液相平衡數(shù)據(jù)，以硫酸銨的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)X，乙醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)Y，建立函數(shù)y1=0.0358x2-2.6402x +58.228，r=0.9990(x?［5.07 -34.5］)，見圖1。

2.1.2 鹽析曲線(雙水相相區(qū)和固液三相區(qū)的分界線［4］)的測定

以上述濁點(diǎn)曲線實(shí)驗(yàn)中配制的雙水相體系為基礎(chǔ)，繼續(xù)滴加無水乙醇，至體系剛好出現(xiàn)微量硫酸銨的絮狀沉淀，靜置15 min 后，沉淀不消失，記錄此點(diǎn)體系各組分的量，該點(diǎn)即為雙水相鹽析點(diǎn)的液-液相平衡數(shù)據(jù)，以硫酸銨的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)X，乙醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)Y，建立函數(shù)y2=-1.3887x+59.03，r=0.9995(x?［5.07 -34.5］)，見圖1。

圖1 硫酸銨-乙醇雙水相相圖Fig.1 The phase diagrams of (NH4)2SO4and CH3COOH aqueous mixtures

2.2 紅梅消總皂苷含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備

稱取齊墩果酸對照品0.007 g，精密稱定，置于25 mL 容量瓶內(nèi)，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.3044 mg/mL 的齊墩果酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取紅梅消藥材粉末10 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 g 硫酸銨-乙醇雙水相，浸泡1 h，超聲30 min，過濾，取上層濾液適量，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 含量測定方法

精密移取上述對照品和供試品溶液適量于20 mL 具塞試管中，水浴揮干溶劑，冷卻至室溫，依次加入0.2 mL 新配制5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻，于80 ℃水浴反應(yīng)15 min 取出，立即用冰水冷卻，加入5 mL 冰醋酸稀釋，搖勻，于30 min后測定其在545 nm 處的吸光度。按根據(jù)最小二乘法計(jì)算出紅梅消總皂苷含量測定的回歸方程，回歸方程為:y=8.161x-0.014(r=0.9995)。結(jié)果表明，在0.01522～0.24352 mg 含量范圍內(nèi)，顯色后的齊墩果酸對照品溶液含量與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 雙水相提取工藝的星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.3.1 中心點(diǎn)與因素水平范圍的優(yōu)化

依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法原理及其因素水平設(shè)計(jì)要求，結(jié)合實(shí)際操作的可能性，將圖1 中雙水相區(qū)域硫酸銨的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(X)范圍平均分為7 份，每個(gè)等分點(diǎn)記為xi(x1～x8)，每個(gè)點(diǎn)分點(diǎn)之間的距離記為一個(gè)步長a(a=4.14)，將其分別帶入濁點(diǎn)曲線和鹽析曲線，得到對應(yīng)的乙醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(Y)yi-1和yi-2，而點(diǎn)zi(xi，yi-2-yi-1)即為整個(gè)雙水相區(qū)域的平均點(diǎn)(見圖1)。將zi點(diǎn)作為兩相質(zhì)量百分比條件，對紅梅消藥材進(jìn)行雙水相提取。依據(jù)獲得的zi點(diǎn)總皂苷含量值，找出中心點(diǎn)，并限定個(gè)因素水平的范圍。

2.3.2 因素水平的設(shè)計(jì)

選擇乙醇和硫酸銨的質(zhì)量百分比作為主要影響因素，設(shè)計(jì)效應(yīng)面因素水分分布，如表1 所示。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levelsof central composite design

2.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用Excel2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Design Expert8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)分析及3D 作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 中心點(diǎn)與因素水平范圍的確定

將2.3.1 中所測得結(jié)果(見表2)進(jìn)行分析:以z2(9.21，41.60)點(diǎn)為條件的總皂苷含量最高，表明在此雙水相體系中，以此點(diǎn)及其附近區(qū)域?yàn)闂l件提取得到總皂苷含量相對較高，故以此點(diǎn)為星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平的中心點(diǎn);由于星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)要求個(gè)因素水平需要范圍限制，而雙水相提取中也存在對需對各相質(zhì)量百分比進(jìn)行限定才能成相的問題，故以步長a 小于z2到曲線y1和y2的最短距離，故用步長a×2 作為因素水平的范圍值，即硫酸銨wt%的范圍為5.07～13.35;乙醇wt%范圍為37.46～45.74。通過此因素水平的范圍限定，可使效應(yīng)面優(yōu)化出的結(jié)果全部落在雙水相成相范圍內(nèi)，使設(shè)計(jì)更有理據(jù)，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠且符合實(shí)際。

表2 取點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)Table 2 Design of points and results (n=3)

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及效應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝

3.2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別取紅梅消藥材粉末100 g，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用2 因素5 水平共計(jì)13 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)效應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)Table 3 Central composite design and results (n=3)

3.2.2 模型擬合分析

以紅梅消總皂苷得率為因變量對各因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，擬合模型如下:Z=2.61-0.032X +0.025Y-0.20XY-0.032Y2-0.54X2Y-0.32XY2(R2=0.9809)上述擬合式中，R 為紅梅消總皂苷得率(%)，X 為硫酸銨質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，Y 為乙醇質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析見表4。

表4 效應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

表4 就線性項(xiàng)、二次項(xiàng)、以及交互項(xiàng)對紅梅消總皂苷提取得率的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，乙醇質(zhì)量百分比的二次項(xiàng)(Y2)、硫酸銨與乙醇質(zhì)量百分比的二次項(xiàng)交互作用(X2Y、XY2)(P ＜0.0001)對模型具有高度顯著性;硫酸銨與乙醇質(zhì)量百分比的項(xiàng)交互作用(XY)(P=0.0008)對模型具有顯著性;得到硫酸銨與乙醇質(zhì)量百分比之間的三維效應(yīng)面曲線，見圖2。

圖2 硫酸銨wt%(X)、乙醇wt%(Y)對總皂苷得率(%)影響的3D 效應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot (3D)showing the effect of(NH4)2SO4(X)and CH3COOH(Y)on the response value of total saponin yield

3.2.3 雙水相最佳配比的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Design Expert 軟件分析預(yù)測得到最佳工藝為:X為12.14，Y 為40.01，即硫酸銨wt% (X)為12.14%、乙醇wt%(Y)為40.01%?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)及放大生產(chǎn)的可操作性，將最佳配比調(diào)整為硫酸銨wt%(X)為12.14%、乙醇wt%(Y)為40.00%，預(yù)測得紅梅消總皂苷含量為2.97%。

對優(yōu)化的提取工藝最佳配比進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果優(yōu)化工藝測得總皂苷含量為2.95%(n=6)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)為1.52%，模型預(yù)測值為2.97%，實(shí)測值與預(yù)測值非常接近，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性、有效性。同時(shí)也說明了響應(yīng)面分析法適用于雙水相體系中質(zhì)量百分比的優(yōu)化。

3.3 不同提取方法的比較

為驗(yàn)證雙水相提取紅梅消總皂苷較傳統(tǒng)提取的優(yōu)越性，故將雙水相提取法與其他常用提取方法進(jìn)行比較研究，料液比均為1∶10，各方法的提取條件分別為:回流提取法，70%乙醇，回流時(shí)間1.5 h;超聲提取法，70%乙醇，常溫下浸泡1 h，超聲0.5 h;雙水相浸泡提取法:硫酸銨12.14%，無水乙醇40.00%，浸泡1.5 h;超聲耦合雙水相浸泡提取法:硫酸銨12.14%，無水乙醇40.00%，浸泡1 h，超聲0.5 h。結(jié)果見表5。

在表5 中，用現(xiàn)今普遍采用的回流提取法，得到紅梅消總皂苷的含量為2.11%，并以此為基準(zhǔn)，計(jì)算各種提取法所得總皂苷含量的提升率。由表5 結(jié)果可知，超聲提取與雙水相浸置分別比回流法提取率低13.74%和70.14%，而雙水相耦合超聲提取較回流提取提取率高39.81%，表明超聲耦合雙水相提取法明顯優(yōu)于其他提取方法。

表5 不同提取方法的皂苷得率結(jié)果(n=3)Table 5 Total saponin yield using different extraction methods(n=3)

3.4 超聲時(shí)間的考察

分別稱取紅梅消藥材粉末各10 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 g 硫酸銨-乙醇雙水相(硫酸銨12.14%、乙醇40.00%)，浸泡1 h，分別超聲15、30、45、60、90、120 min，過濾，取上層濾液適量，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，采用香草醛-高氯酸顯色的紫外分光光度法，在545 nm 下測定其吸光度值，計(jì)算總皂苷的得率。結(jié)果表明超聲時(shí)間越長，總皂苷得率越高，但超聲45 min 及以后，總皂苷的得率為2.96%～2.98%，與超聲30 min 的總皂苷得率2.95%(n=3，RSD=1.53%)相差不大，且超聲時(shí)間過長會(huì)造成時(shí)間及資源浪費(fèi)，故選擇超聲時(shí)間為30 min。

4 討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面分析法與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)等應(yīng)用于中藥材提取的設(shè)計(jì)方法相比，具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)次數(shù)少，試驗(yàn)精度高，分析結(jié)果直觀、方便等優(yōu)點(diǎn)，在藥學(xué)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域里正得到廣泛的應(yīng)用［5］。近年來，星點(diǎn)設(shè)計(jì)法對雙水相提取進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道［6-8］缺乏對星點(diǎn)設(shè)計(jì)的全面理解，所設(shè)計(jì)的因素缺乏一定的范圍約束，會(huì)造成雙水相中各物質(zhì)比例范圍變大，部分條件不能形成雙水相體系，導(dǎo)致所擬合出的效應(yīng)曲面部分超出因素取值范圍以外(實(shí)際提取實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)出現(xiàn)單液相、固液兩相或三相等情況)，造成模擬效應(yīng)曲面模型可信度低，優(yōu)化出的條件與實(shí)際偏離大準(zhǔn)確度低。

本文首次僅在雙水相的兩相質(zhì)量百分配比上采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化分析，通過在雙水相圖中找特征點(diǎn)(趨勢點(diǎn))縮小因素取值范圍，使因素水平有線性范圍約束，滿足雙水相成相條件要求，使設(shè)計(jì)更有理據(jù)，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠且符合實(shí)際;又因其設(shè)計(jì)因素少，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，精度高，分析結(jié)果更加直觀，故此分析設(shè)計(jì)法可在優(yōu)化雙水相提取中的兩相質(zhì)量百分配比上得到廣泛的應(yīng)用與推廣。

雙水相提取分離技術(shù)現(xiàn)多以無機(jī)鹽代替高聚物的普通有機(jī)物的雙水相體系，尤其是適用極性物質(zhì)的提取和純化。皂苷類物質(zhì)在水飽和正丁醇中溶解性能較佳，但正丁醇沸點(diǎn)高，難回收;而低濃度乙醇對皂苷也有不錯(cuò)的溶解性，且回收方便，因此選擇無水乙醇為雙水相體系的有機(jī)相。

通過實(shí)驗(yàn)考察了NaCl、(NH4)2SO4和K2HPO4與無水乙醇的成相能力，發(fā)現(xiàn)NaCl 與無水乙醇無法形成雙水相體系;K2HPO4與無水乙醇形成的雙水相體系分相能力較弱，相比過大;(NH4)2SO4與無水乙醇形成的雙水相體系成相穩(wěn)定，而且提取液中(NH4)2SO4可用甲醇除去，不影響總皂苷的含量測定，故采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取紅梅消總皂苷。

紅梅消總皂苷現(xiàn)多以70%乙醇回流提取，但因其藥材質(zhì)地較輕、體積較大，致使在熱醇回流時(shí)藥材始終浮于液面上，耗時(shí)耗能且提取率較低［9］。超聲耦合雙水相提取技術(shù)，首次運(yùn)用于紅梅消總皂苷的提取工藝中，提取時(shí)藥材位于兩相之間，與兩相均有充分的接觸，提取過程中，皂苷類產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至乙醇上相，可改變提取過程中的化學(xué)平衡，有利于更多皂苷類物質(zhì)溶出［6］。整個(gè)提取工藝常溫下即可進(jìn)行，避免了某些活性成分因高溫分解而損失，而且縮短了提取時(shí)間，大大的提高了皂苷的提取率，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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