兒童手足口病病例中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型的調(diào)查分析

蘇文錦

云南省臨滄市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南臨滄 677000

2011年2月—2013年8月，我科診斷250例患手足口病者，在取得患兒家庭的同意之后，從250例患手足口病兒童中抽選出69例作為病原學(xué)分析對(duì)象，在69例病原學(xué)分析對(duì)象中，手足口病伴隨腦炎的有3例?；际肿憧诓和牟≡瓕W(xué)的調(diào)查分析狀況，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年2月—2013年8月，我科從250例患手足口病兒童中抽選出69例作為病原學(xué)分析對(duì)象，調(diào)查分析患手足口病兒童的病原學(xué)。在初診病例之中，250例患手足口病兒童，男性150例，女性100例，年齡：8 個(gè)月到13歲。在抽選的手足口病兒童69例分析病例之中，男性38例，女性31例，年齡：1～12歲，平均（7.05±2.50）歲，無(wú)論是初診的250例患手足口病兒童病例，還是選出的手足口病兒童69例分析病例，在年齡構(gòu)成、性別構(gòu)成、病狀構(gòu)成上無(wú)顯著差異，P＞0.05。病例標(biāo)本均于患病7 d 中收集，其中，在3 d 中收集的有62例，在4～7 d 中收集的有7例。在收集的69例標(biāo)本病例中，幼托機(jī)構(gòu)病兒47例；手足口病病毒明確接觸史35例；48例發(fā)病年齡為3～6歲。

1.2 調(diào)查方法

1.2.1 收集標(biāo)本 經(jīng)常規(guī)消毒清潔之后，將手足口病兒童所發(fā)皰疹之中的水皰液體進(jìn)行收集，與此同時(shí)，經(jīng)消毒滅菌棉簽收集兒童深部咽拭子，并收集5 克手足口病兒童糞便，隨后，將所收集標(biāo)本保存并冷藏于-40℃處[1]。

1.2.2 分離病毒 將所收集的水皰液標(biāo)本懸液進(jìn)行Vero 細(xì)胞、RD細(xì)胞接種，與此同時(shí)，對(duì)糞便標(biāo)本懸液以及咽拭子標(biāo)本懸液也予以Vero 細(xì)胞、RD 細(xì)胞接種，隨后，將接種后的糞便標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本以及水皰液標(biāo)本培養(yǎng)于36℃到37℃處。此外，每代觀察時(shí)長(zhǎng)為1 周（7d），2 代觀察時(shí)長(zhǎng)共為2 周（14d），當(dāng)CPE(細(xì)胞病變)為“++++”之時(shí)予以收獲，并將之置放并保存于-20℃處.

1.2.3 血清學(xué)鑒定（病毒分離株）首先，經(jīng)EV 組合血清鑒定病毒分離株，隨后，通過(guò)EV71 以及CA16 單價(jià)血清對(duì)病毒分離株之中未能定型的予以鑒定。

1.2.4 鑒定PT-PCR（病毒分離株）對(duì)于病毒分離株之中用血清學(xué)不能定型的要通過(guò)RT-PCR 進(jìn)行定型，隨后合成為CA16型的特異性引物（含VP1 因子）與EV71型的特異性引物（含VP1 因子）。其中，EV71型的特異性引物（上下游引物）能夠?qū)NA 片段（332bp）予以擴(kuò)增。CA16型的特異性引物（上下游引物）能夠?qū)NA 片段（221bp）予以擴(kuò)增。

1.2.5 試管分析 隨后，通過(guò)QIamp Viral RNA Mini kit（德國(guó)所產(chǎn)，Qiagen）將病毒之中含有的RNA 予以提取。隨后，將Reardy-to-GO RT-PCR Bead（瑞典，1 粒）以及1μL 上下游引物、43μl 的DEPC 水、2μl 的酶抑制劑（RNA）、1μl 的病毒RNA 加入每支PCR試管之中，整體反應(yīng)體積為50μl。在PCR 試管之中所做反應(yīng)有：10min72℃；60s72℃，30s 55℃，30s 95℃，35 個(gè) 循 環(huán)；3min94℃，45min42℃。隨后，將PCR 產(chǎn)物放置于瓊脂糖凝膠（3%）經(jīng)電泳之后予以分析。與此同時(shí)，并抽出病毒9 株送往疾病預(yù)防控制中心鑒定分析VP1 區(qū)之中的核苷酸序列[2-3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn)：t 檢驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)差以及均數(shù)表示計(jì)量資料，計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)：χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件：SPSS 16.0[4]。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

在抽選的手足口病兒童69例分析病例之中，一共收集標(biāo)本100 份，其中，有糞便標(biāo)本30 份，咽拭子標(biāo)本35 分，皰疹液標(biāo)本35 份。對(duì)這些標(biāo)本行病毒分離。分離結(jié)果顯示，從標(biāo)本病例之中分離出病毒的有65例，因此檢出病毒概率：94.20%。在100 份檢出標(biāo)本之中，分離出病毒的有89 份，包括：皰疹液標(biāo)本30 份，咽拭子標(biāo)本29 份，糞便標(biāo)本30 份，病毒分離陽(yáng)性概率：89.00%，且標(biāo)本與標(biāo)本間分離的病毒陽(yáng)性率無(wú)顯著差異，P＞0.05。

2.2 血清學(xué)鑒定結(jié)果

EV 組合血清能夠?qū)？刹《?～7 以及33 病毒、30 病毒、29病毒、27 病毒、25 病毒、20～22 病毒、11～14 病毒、柯薩奇B、CA9、脊髓灰質(zhì)炎病毒予以鑒定，所鑒定出病毒的89例檢測(cè)標(biāo)本通過(guò)EV組合血清行中和試驗(yàn)病毒定型，未發(fā)現(xiàn)上述血清型別病毒，于是再經(jīng)EV71 以及CA16 單價(jià)血清予以中和試驗(yàn)，鑒定結(jié)果為陰性。

2.3 鑒定RT-PCR 結(jié)果

因?yàn)榻?jīng)血清學(xué)方法無(wú)法將分離病毒型別鑒定出來(lái)，所以經(jīng)RT-PCR 予以鑒定。在分離出病毒的89 份試驗(yàn)標(biāo)本之中，經(jīng)RTPCR（2 對(duì)引物）對(duì)病毒擴(kuò)增VP1 段，結(jié)果都出現(xiàn)PCR 產(chǎn)物，且CA16 引物表現(xiàn)出211bp 段擴(kuò)增，詳見(jiàn)圖1。EV71 引物表現(xiàn)出322bp 段擴(kuò)增，詳見(jiàn)圖。

2.4 鑒定結(jié)果

55例77 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：CA16，10例12 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：EV71。此外，抽出9 株送往疾病預(yù)防中國(guó)控制中心鑒定的病毒（CA167 株、EV712 株）測(cè)定序列和RT-PCR 測(cè)定一致。

圖1 CA16 引物的PCR 產(chǎn)物電泳

圖2 EV71 引物的PCR 產(chǎn)物電泳

2.5 臨床資料

比較55例77 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：CA16，10例12 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：EV71 的病例資料，無(wú)顯著差異，P＞0.05。具體見(jiàn)表1。

表1 病毒分離株類(lèi)型病例臨床資料對(duì)比

3 討論

本文旨在調(diào)查分析患手足口病兒童的病原學(xué)，從標(biāo)本病例之中分離出病毒的有65例，因此檢出病毒概率：94.20%。在100 份檢出標(biāo)本之中，分離出病毒的有89 份，病毒分離陽(yáng)性概率：89.00%。經(jīng)EV71 以及CA16 單價(jià)血清予以中和試驗(yàn)，鑒定結(jié)果為陰性。經(jīng)RT-PCR 予以鑒定。因?yàn)榻?jīng)血清學(xué)方法無(wú)法將分離病毒型別鑒定出來(lái)，所以經(jīng)RT-PCR 予以鑒定。在分離出病毒的89 份試驗(yàn)標(biāo)本之中，經(jīng)RT-PCR（2 對(duì)引物）對(duì)病毒擴(kuò)增VP1 段，結(jié)果都出現(xiàn)PCR 產(chǎn)物，且CA16 引物表現(xiàn)出211bp 段擴(kuò)增。EV71 引物表現(xiàn)出322bp 段擴(kuò)增。55例77 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：CA16，10例12 份檢出標(biāo)本顯示病毒分離株類(lèi)型：EV71?？梢?jiàn)手足口病兒童病原主要為：EV71、CA16，因此應(yīng)當(dāng)對(duì)EV71、CA16加強(qiáng)預(yù)防[5]。

[1]張建華，江炳福，程險(xiǎn)峰，等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型分離株的VP1 基因特征分析[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，19(12)：173-179，200-201.

[2]曾昭森.熒光RT—PCR 同步檢測(cè)腸道病毒71型和柯薩奇病毒A 組16型方法的建立及應(yīng)用[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，11(16)：1327-1328.

[3]李國(guó)英，李潤(rùn)青，張曉慧，等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A 組致手足口病臨床特點(diǎn)分析[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)（學(xué)術(shù)研究文集），2012，15(11)：1271-1272.

[4]魏貫峰，周素華，胡強(qiáng).腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型抗體篩查在手足口病中的應(yīng)用及相關(guān)性[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志，2012，35(16)：20-22.

[5]姚瑤，趙秀英，何菡，李潤(rùn)青，等.手足口病患者體內(nèi)腸道病毒71型和柯薩奇病毒A 組16型與常見(jiàn)呼吸道病毒的檢測(cè)及臨床分析[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34(18)：695-699.