高活性玉米醇溶蛋白提取工藝的研究

王宇曉 陶海騰 徐同成 劉麗娜 邱 斌劉 瑋 劉振華 杜方嶺 董海洲

高活性玉米醇溶蛋白提取工藝的研究

王宇曉1，2陶海騰2徐同成2劉麗娜2邱 斌2劉 瑋2劉振華2杜方嶺2董海洲

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，泰安 271018）
（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所2，濟南 250100）

為了得到活性最高的玉米醇溶蛋白（zein），以DPPH·清除率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。通過對提取時間、乙醇體積分數(shù)、溫度進行單因素試驗，進行多重比較后，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計進行優(yōu)化。影響因素主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞時間＞溫度。優(yōu)化后的提取條件：提取時間50 min、乙醇體積分數(shù)55%、溫度38℃。在此提取條件下，驗證其自由基的清除率達到58.58%，同時提取率達到72.67%，優(yōu)化的條件兼顧了抗氧化活性和提取率。

響應(yīng)面法 玉米醇溶蛋白 自由基清除率 抗氧化

玉米醇溶蛋白（zein）是由平均相對分子質(zhì)量為25 000～45 000的蛋白質(zhì)組成的混合物，它受肽主鏈上的羥基與亞氨基的氫鍵作用，形成α-螺旋體；有底表面能，具有獨特的成膜特性，并且對環(huán)境影響小，生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛。Gorham于1821年命名了zein，幾乎所用的zein都在胚乳中，而谷蛋白分布在胚乳和胚芽之間［1］。玉米蛋白粉（CGM）為玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，蛋白含量超過60%，是zein提取的主要原料。目前，zein的獲得主要通過以乙醇、異丙醇等醇類溶劑法提取。Takahashi等［2］用95%乙醇，按料液比1∶8在70℃水浴下混合15 min從CGM提取zein，然后在-10℃下沉淀蛋白。Wu等［3］用88%異丙醇在pH 12.5從CGM中提取zein，然后冷凍沉淀，回收率21.3%～32.0%，純度82.1%～87.6%，技術(shù)比較成熟。但以往的研究在關(guān)注得率和純度的同時，卻忽略了提取條件對生物活性的影響。

提取過程中的pH值、溫度、溶劑濃度等因素都會對玉米醇溶蛋白的生物活性有一定的影響，Zhang等［4］研究了酸堿處理對α-zein結(jié)構(gòu)、流變性和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)在pH 2.7與12.5下其抗氧化活性比pH 3.3、6.5、10.5的要高，這可能是由于在pH 2.7和12.5下谷氨酰胺更容易脫酰胺形成谷氨酸，但是酸性條件下α-zein的結(jié)構(gòu)已經(jīng)改變。蛋白或者多肽的抗氧化活性與特定的氨基酸殘基或短肽有關(guān)系［5-6］，Saiga等［7］發(fā)現(xiàn)富含天冬氨酸和谷氨酸的短肽具有很強的抗氧化活性，zein的自由基清除能力與其含有的 His、Arg、Ala、Val、Met、Leu等有關(guān)系［8］。本研究從抗氧化活性入手，研究提取條件的改變對zein抗氧化活性的影響。試驗對提取因素進行優(yōu)化，以DPPH·清除率為指標(biāo)，為高活性玉米醇溶蛋白的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGM：西王集團；DPPH：Sigma公司；分析純無水乙醇：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754N紫外可見分光光度計：上海奧譜勒儀器有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀：美國海能；CR22GⅢ高速冷凍離心機：日立公司；HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵：鞏義京華儀器責(zé)任有限公司；lab dancer渦旋：IKA。

1.3 方法

1.3.1 CGM脫色

因zein不溶于無水乙醇，因而采用無水乙醇進行超聲脫色。按照1∶6料液比，脫色2次［9］，得到充分脫色的玉米蛋白粉。

1.3.2 DPPH·清除率計算

0.1 mL提取溶劑加入 3.9 mL（0.04 mg／mL）DPPH·記為 B1，0.1 mL樣品加入 3.9 mL（0.04 mg／mL）DPPH·記為 B2［10］，混勻后避光反應(yīng) 30 min，在517 nm下測定吸光度。

DPPH·清除率／% ＝（1-B2／B1）×100

1.3.3 單因素試驗

準(zhǔn)確稱取脫色蛋白粉0.500 0 g，加入10 mL離心管中，加入料液比1∶6［9］的乙醇水溶液，然后渦旋充分，平行3次。在其他條件相同的情況下，對時間、乙醇體積分數(shù)、溫度進行試驗，研究各個因素對DPPH·清除率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，本試驗選取的參數(shù)范圍為：時間40～50 min，乙醇體積分數(shù)55%～65%，溫度38～42℃，選用三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計進行試驗，其因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.3.5 粗蛋白含量測定

稱取0.500 0 g脫色蛋白粉，按照玉米類粗蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)6.25［11］，用凱氏定氮儀測定粗蛋白含量A1。用移液槍吸取1mL提取液，按轉(zhuǎn)化系數(shù)6.25測定粗蛋白含量A2。

提取率／%＝A2×離心液體體積÷（A1×0.500 0），因按1∶6料液比，其中離心液體體積按3 mL計算。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗及粗蛋白含量測定進行3次平行試驗，試驗結(jié)果用SAS 9.2進行LSD法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 時間對DPPH·清除率的影響

在乙醇體積分數(shù)80%，溫度45℃下，研究不同的提取時間對DPPH·清除率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在0～45 min其自由基清除率快速上升，在45～90 min其自由基清除率依然上升但是上升速率減慢。盡管通過多重比較，75～90 min DPPH·清除率相對最高，但是耗時過長。60 min比45 min的清除率提高2.68%，盡管75 min自由基清除率高，但是考慮過長時間可能對蛋白產(chǎn)生不利影響且能耗高，因而選取時間為45 min。

圖1 時間對DPPH·清除率的影響

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對DPPH·清除率的影響

在時間45 min，溫度45℃下，研究不同的乙醇體積分數(shù)對DPPH·清除率的影響。通過圖2可知，用60%的乙醇溶液，其DPPH·清除率最大。60%與70%的乙醇之間差異不大。但是90%的DPPH·清除率急速下降，這可能是因為zein在乙醇體積分數(shù)低于40%或者高于90%時，都產(chǎn)生沉淀和絮凝2個狀態(tài)［12］，其溶解度比較低［13］。

圖2 乙醇體積分數(shù)對DPPH·清除率的影響

2.1.3 溫度對DPPH·清除率的影響

圖3 溫度對DPPH·清除率的影響

在時間45 min，乙醇體積分數(shù)60%下，研究不同的溫度對DPPH·清除率的影響。通過圖3，溫度40℃時，DPPH·清除率最高，且不同溫度對DPPH·清除率的差異顯著。DPPH·清除率總體趨勢在40℃達到最大，然后下降，因而選取溫度40℃。

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

由表3主模型方差分析可看出，X2、X1X3、X2X3為顯著性影響因素。其模型的顯著性 P＞F為0.016 3，達到顯著水平。R2為0.936 2，說明響應(yīng)值的變化有0.936 2來源于所選變量。上述結(jié)果表明模型能夠較好反映響應(yīng)值的變化，模型擬合程度較好。由表3可以看出，影響因素主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞時間＞溫度。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 主模型自由基清除率方差分析

表4 預(yù)測模型自由基清除率方差分析

根據(jù)表3，選取顯著性因素 X2、X1X3、X2X3和所選因素X1、X3進行預(yù)測模型擬合。表4可見，模型的P＞F值為0.000 4，達到極顯著水平。預(yù)測模型為Y1＝54.69+0.70X1-1.40X2-0.62X3-2.43X1X3-1.24X2X3，其清除率優(yōu)化結(jié)果為時間50 min，乙醇體積分數(shù)55%，溫度38℃，此時DPPH·清除率達到58.60%。在最優(yōu)條件下進行試驗，實際DPPH·清除率為58.58%，模型可以較好預(yù)測DPPH·清除率。試驗得到的zein的DPPH·清除率遠比Zhang等［4］研究用的商品α-zein高，這與提取的zein中β與γ殘基的存在有關(guān)。

圖4 時間（X1）和乙醇體積分數(shù)（X2）對DPPH·清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 時間（X1）和溫度（X3）對DPPH·清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 乙醇體積分數(shù)（X2）和溫度（X3）對DPPH·清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖

通過圖4，可以看出時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用不顯著。圖5中，通過等高線的疏密，可以看出時間與溫度交互作用顯著。圖6中，乙醇濃度與溫度的交互作用也顯著。

2.3 醇溶蛋白含量

試驗測得脫色蛋白粉粗蛋白含量63.98%，1 mL提取液醇溶蛋白含量7.75%。通過公式，提取率達到72.67%。

3 結(jié)論

試驗以DPPH·清除率為指標(biāo)，與以得率或純度為指標(biāo)的研究點不同。通過研究時間、乙醇體積分數(shù)、溫度對DPPH·清除率影響，得到其影響因素主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞時間＞溫度。

通過響應(yīng)面優(yōu)化確定參數(shù)為時間（X1）50 min，乙醇體積分數(shù)（X2）55%，溫度（X3）38℃，DPPH·清除率達到58.58%。同時，提取率達到72.67%。本試驗優(yōu)化的條件兼顧了抗氧化活性和提取率。

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Extraction Technology of Zein with High Bioactivity

Wang Yuxiao1，2Tao Haiteng2Xu Tongcheng2Liu Lina2Qiu Bin2Liu Wei2Liu Zhenhua2Du Fangling2Dong Haizhou1
（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University1，Taian 271018）
（Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences2，Jinan 250100）

In order to get the zein with higher activity，the DPPH radical scavenging rate was used as response value.Time，ethanol concentration and temperature were treated as the three single factors.After multiple comparisons，the conditions of DPPH radical scavenging rate were optimized by Box-Behnken response surface method.The order of primary factors：ethanol concentration＞time＞temperature.The conditions could be optimized as following：time 50 min，ethanol concentration 55%，temperature 38℃.The DPPH radical scavenging rate was 58.58%，and extraction rate reached 72.67%，the optimal condition guarantee both antioxidant activity and extraction rate.

response surface，zein，radical scavenging rate，antioxidant

TS253.1

A

1003-0174（2014）03-0047-05

863計劃（2013AA102206）

2013-05-23

王宇曉，男，1989年出生，碩士，糧油加工

董海洲，男，1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧油食品加工