黃花蒿青蒿酸制備及其生物穩(wěn)定性研究

徐定華，唐雯熙，張曉蓉*，李 杰，劉繼旋

1吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室;2 吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南吉首 416000

青蒿酸是黃花蒿(Artemisia annuaL.)植物中倍半萜類成分之一［1-4］，化學構象適宜，具有重要的藥用和開發(fā)價值，我國資源豐富。研究表明青蒿酸具有較好的抗腫瘤活性，對人肝癌細胞SMMC-7721、人白血細胞K562、白血病P388 等多種癌細胞具有殺傷作用［5，6］。還可減少C/EBPδ mRNA 的水平，抑制hAMSCs 的生脂分化［7］。青蒿酸為青蒿素生物合成重要前體，有望低成本體外轉化為青蒿素，近年來青蒿酸制備技術也隨之發(fā)展，已有多種青蒿酸分離純化工藝報道，如采用反相高效液相色譜法分離青蒿酸［8］，產物純度大于96%;采用皂化-硅膠柱層析法從青蒿酸提取母液制備青蒿酸［9］，純度達95%。也有報道通過單流程工藝制備較高純度青蒿酸［10］。國外有報道通過酵母轉基因技術生物合成青蒿酸。雖然已有多種青蒿酸制備工藝報道，目前青蒿酸尚未實現工業(yè)化，一些關鍵技術還有待解決;有關青蒿酸生物穩(wěn)定性未見相關報道。青蒿酸分子含有一個羧基，4，5-位以及11-位碳雙鍵易斷裂，通過紫外光斷裂11-位雙鍵，插入一個甲基和2 個氫，生成二氫青蒿酸，青蒿酸在光氧化條件下氧化其4，5-位雙鍵，生成烯丙過氧氫，提供氯化氫條件，甲酯化生成青蒿酸甲酯，分子中雙鍵使青蒿酸具有一定不穩(wěn)定性［11-13］?；谇噍锼嶂匾拈_發(fā)應用價值，本文探究了溶劑法、吸附分離法制備青蒿酸，對產品進行了表征，分析了青蒿酸的生物穩(wěn)定性，以期為青蒿酸的工業(yè)開發(fā)與利用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黃花蒿(Artemisia annuaL.)為野外采集，由吉首大學陳功錫教授鑒定。青蒿酸標準品(HPLC ＞99%，批號120628，四川省維克奇生物科技有限公司)。

島津高壓液相色譜儀(LC-10AT，天津島津液壓有限公司)，干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)，申光熔點儀(WRR，上海精科)，紫外分光光度計(天津島津液壓有限公司)，紫外燈(253.7 nm，30 W)，高分辨質譜儀(MAT95XP，美國Thermo Finnigan 公司)，96 孔細胞培養(yǎng)皿，甲醇(HPLC，上海國藥)，乙腈(HPLC，上海國藥)，其它試劑均為國產分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 青蒿酸制備工藝

將1000 g 黃花蒿植物于60 ℃干燥至恒重，粉碎，過40 目篩，甲醇浸提24 h/次，3 次，植物∶甲醇=1∶10、1∶10、1∶5(g/mL)。合并濾液，濃縮，浸膏乙醚溶解，并加入堿液24 h 反應后，收集堿液層，濃HCl 調pH=1，24 h 反應，再加入乙醚，萃取，收集乙醚，濃縮，浸膏硅膠柱層析分離，收集青蒿酸流份，濃縮，乙酸乙酯溶解浸膏，-20 ℃結晶，收集青蒿酸結晶，真空干燥，備用。

1.2.2 青蒿酸表征

1.2.2.1 青蒿酸溶液配制

精確稱量青蒿酸標準品及青蒿酸樣品各10 mg，色譜甲醇溶解，容量瓶定量至10 mL，母液濃度為1 mg/mL，備用。實驗用青蒿酸標準品溶液及青蒿酸樣品溶液均采用色譜甲醇稀釋。

1.2.2.1 熔點測定

取5 mg 青蒿酸晶體于50 ℃干燥至恒重，研磨，于熔點儀中測定其熔點，重復3 次。

1.2.2.2 UV-vis 表征

青蒿酸甲醇溶液于比色皿掃描分析，波長范圍200～450 nm 掃描，以甲醇為空白對照，測定青蒿酸最大吸收峰。

1.2.2.3 TLC 分析

展層劑:石油醚-乙酸乙酯-丙酮(80∶19∶1，v/v/v);顯色劑:香草醛-無水乙醇-濃硫酸(0.5 g∶9 mL∶1 mL);顯色溫度:100～110 ℃;顯色時間:5～10 min。

1.2.2.4 HPLC 檢測

精密吸取青蒿酸樣品溶液10 μL，注入液相色譜儀，紫外檢測器測定峰面積。色譜柱條件:wondas II C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(7∶3，v/v);流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃，紫外檢測波長為203 nm。

青蒿酸濃度計算公式如下:

1.2.2.5 質譜分析

青蒿酸溶解于乙醚溶液用于質譜檢測分析。質譜檢測條件為毛細管溫度180 ℃，噴霧電壓5 kV，離子透鏡補償電壓15 V，碰撞能量20%～42%，殼氣為氮氣，毛細管電壓38 V，注射泵流速3 μL/min。

1.2.3 生物穩(wěn)定性檢測

光照條件:取三組供試青蒿酸樣品溶液，第一組采用自然光照室溫保存，第二組用錫箔紙包裹避光室溫保存。第三組供試樣品溶液分別以每孔300 μL 加入96 孔板，室溫紫外燈下照射，光照距離20 cm，取樣待檢。

溫度條件:取三組供試青蒿酸樣品溶液，第一組4 ℃條件下避光保存，第二組室溫條件下避光保存，第三組60 ℃條件下避光保存，取樣待檢。

保存時間:供試青蒿酸溶液，室溫避光保存。植物樣品為野外采集，自然陰干，室溫避光貯藏，植物青蒿酸含量檢測采用甲醇室溫提取，1年保存時間。

HPLC 法檢測生物活性，青蒿酸標準品溶液及樣品溶液濃度均為0.08 mg/mL。

2 結果與分析

2.1 青蒿酸制備工藝

黃花蒿青蒿酸制備工藝流程如圖1 所示。制備工藝設計了有機溶劑提取、反萃取-萃取粗分離、吸附柱分離及結晶、真空干燥等4 個操作單元制備。青蒿酸分子中含有一個羧基，屬于極性分子，制備工藝選用極性較強的有機溶劑甲醇提取。青蒿酸呈弱酸性，為弱電解質，工藝采用5% NaOH 皂化及濃HCl 還原，利用反萃取及乙醚萃取粗分離。通過硅膠柱吸附分離法以及石油醚結晶精制，得到青蒿酸產品。通過該工藝產物得到青蒿酸結晶350 mg，制備工藝的產率為61.7%，青蒿酸制備工藝物料平衡及產品收率總結于表1。

圖1 青蒿酸制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process of artemisinic acid

表1 青蒿酸制備工藝物料平衡及產品收率Table 1 Material balance and product yield of artemisinic acid by preparation process

2.2 青蒿酸表征

采用HPLC 法對產物青蒿酸進行了純度檢測，對青蒿酸晶體進行了UV-vis、熔點、TLC、質譜表征，結果如圖2 所示。產物青蒿酸純度為96% (圖2 A)。青蒿酸晶體透明，小立方形(圖2B 插圖所示)。青蒿酸晶體甲醇溶解后，紫外檢測表明最大吸收峰為220 nm;青蒿酸結晶熔點為130(132 ℃;TLC 檢測表明青蒿酸的Rf值為0.42(圖2 C 箭頭所示);質譜檢測其質子峰為［M］+234(圖2 D)，與文獻報道一致［1］。

圖2 青蒿酸表征Fig.2 Characterization of artemisinic acid

2.3 青蒿酸生物穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度穩(wěn)定性分析

青蒿酸具有適宜化學構象，不僅可生物轉化為青蒿素，且具有重要的藥用用途，保持其生物穩(wěn)定性是其開發(fā)利用的前體。因此，探究了4 ℃、室溫、60℃等溫度條件下青蒿酸生物穩(wěn)定性。采用TLC 法、HPLC 法對3 種溫度條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 的青蒿酸含量動態(tài)變化進行了定性定量分析。TLC 分析結果顯示，4 ℃、室溫、60 ℃條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 后青蒿酸斑點清晰可見，Rf值均為0.46(圖略)。進一步采用HPLC 法對不同溫度條件下保存的青蒿酸含量進行定量檢測，結果如圖3 A、B、C 所示。由檢測結果可知，4 ℃、室溫、60 ℃條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸HPLC 檢測保留時間均為12.6 ± 0.2 min。根據公式計算可知，3 種條件下青蒿酸濃度基本保持不變，分別為0.08、0.08 ±0.01 mg/mL 以及0.075 ±0.05 mg/mL，可見青蒿酸在4～60 ℃溫度條件下具有較好的生物穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度保存條件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.3 Content analysis of artemisinic acid preserved under different temperatures by HPLC

2.3.2 光穩(wěn)定性分析

以避光條件為對照，研究了青蒿酸對紫外光及自然光的生物穩(wěn)定性。TLC 分析結果顯示，自然光照條件保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸斑點仍清晰可見，與避光保存青蒿酸標準品斑點顯示一致。將青蒿酸進行紫外光照0、2、4、6、8、10、12 h，TLC 檢測發(fā)現青蒿酸斑點隨著紫外照射時間延長，斑點逐漸變小，顏色變淡，6 h 后青蒿酸斑點完全消失(圖略)。進一步對自然光及紫外光處理的青蒿酸含量進行HPLC 檢測，結果如圖4 所示。由圖4 A 檢測結果可見，自然光照條件下青蒿酸吸收峰與避光保存標準品吸收峰一致，含量穩(wěn)定，檢測濃度保持在0.07～0.08 mg/mL。紫外光照處理后(圖4 B)，青蒿酸含量隨著紫外光照時間延長逐漸降低，紫外光照2 h 后青蒿酸濃度降為0.04 mg/mL，4 h 后降為0.02 mg/mL，紫外光照8 h 后青蒿酸幾乎完全被光解。以上結果表明，自然光照條件下青蒿酸具有較好的穩(wěn)定穩(wěn)定性，青蒿酸對紫外光非常敏感。

圖4 不同光照保存條件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.4 Content analysis of artemisinic acid preserved under different lights by HPLC

2.3.3 青蒿酸保存時間分析

室溫避光貯藏條件下，對體外及植物體內保存的青蒿酸生物穩(wěn)定性進行了分析。HPLC 檢測結果如圖5 所示。由圖5A 檢測結果顯示，在體外保存1年后，青蒿酸吸收峰與標準品吸收峰一致，含量穩(wěn)定，濃度保持在0.07～0.08 mg/mL。由圖5B 檢測結果可知，植物體在自然條件下保存1年后，青蒿酸含量基本穩(wěn)定，濃度約為1.5%～1.6%，生物穩(wěn)定性良好。以上結果表明，植物體內外保存一年時間青蒿酸生物活性穩(wěn)定良好。

圖5 植物體內外保存青蒿酸含量HPLC 分析Fig.5 Content analysis of artemisinic acid preserved in and out of plant by HPLC

3 討論

青蒿酸具有重要的開發(fā)利用價值。本文探究了青蒿酸制備工藝，通過該工藝可高效制備青蒿酸產品，純度達96%。產物青蒿酸紫外最大吸收峰為220 nm，熔點為130～132 ℃，質譜［M］+234。生物穩(wěn)定性分析表明，4～60 ℃以及自然光照條件下，保存30 d 青蒿酸生物穩(wěn)定性的保持良好，含量保持0.08 mg/mL 不變。但紫外光對青蒿酸具有極強的破壞作用，紫外照射6 h 后青蒿酸基本檢測不出，有報道青蒿酸在紫外條件下，4，5-位以及11-位碳雙鍵斷裂發(fā)生氧化反應［8］，該結果與文獻相符。室溫條件下，青蒿酸在植物體內外保存1年含量基本穩(wěn)定，生物穩(wěn)定性好。青蒿酸良好的生物穩(wěn)定性為其開發(fā)利用提供了廣闊前景。

1 Deng DA (鄧定安)，Zhu DY (朱大元)，Gao YL (高耀良)，et al.Study on structure of artemisinic acid.Chin Sci Bull(科學通報)，1981，19:1209-1211.

2 Deng DA (鄧定安)，Cai JC (蔡俊超).Derivatives of artemisic acid with antitumor activity.Organ Chem(有機化學)，1991，5:540-543.

3 Tu YY(屠呦呦)，Zhu QC (朱啟聰)，Shen X (沈星).Study on chemical composition of shoot ofArtemisia annuaL.Tradit Chin Med J(中藥通報)，1985，10(9):35-37.

4 Deng SJ (鄧思娟)，Li CY (李春遠)，Chen S (陳實)，et al.Allelochemicals isolation and structure identification ofArtemisia annuaL.J South China Agric Univ(華南農業(yè)大學學報)，2008，29(3):42-46.

5 Sun WC (孫瑋辰)，Han JX (韓家嫻)，Yang WY (揚蔚怡)，et al.Antitumor activities of 4 derivatives of artemisic acid and antemisic Bin vitro.Acta Pharmucol Sin(中國藥理學報)，1992，13:541-543.

6 Zhou SW (周生偉)，Wang SY (王莎莉)，Ya P (亞平).Inhibitory effects of artemisinic acid on proliferation of K562 cellsin vitro.J Chongqing Med Univ(重慶醫(yī)科大學學報)，2006，31:159-162.

7 Ro DK，Paradise EM，Ouellet M，et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature，2006，440:940-943.

8 Liu SQ (劉碩謙)，Liu ZH (劉仲華)，Tian N (田娜)，et al.Phase high performance liquid chromatography separation and purification of artemisinin，dihydro artemisinin acid and artemisinic acid.CN201110038895.

9 Liu ZQ (劉志強).A kind method of extract artemisinic acid from artemisinin crystallization mother liquor.CN 102702220B.

10 Peng XD (彭學東)，Zhang H (張海)，Zhao JZ (趙金召)，et al.A simple new process of extraction and purification artemisinin and artemisinin acid fromArtemisia annualeaf.CN 103087075A.

11 Liu SQ (劉碩謙)，Tian N (田娜)，Li J (李娟)，et al.Advances in studies on combinatorial biosynthesis of artemisinin.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2007，38:1425-1431.

12 Zeng QP (曾慶平)，Pao F (鮑飛).Research achievements in the synthetic biology and metabolic engineering of artemisinin.Chin Sci Bull(科學通報)，2011，56:2289-2297.

13 Kong JQ (孔建強)，Wang W (王偉)，Cheng KT (程克棣)，et al.Research progresses in synthetic biology of artemisinin.Acta Pharm Sin(藥學學報)，2013，48:193-205.