t（6；11）染色體易位腎細胞癌中Alpha基因片段的克隆及啟動子活性分析*

詹鶴琴 袁 毅② 秦 蓉

t（6；11）染色體易位腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一類被新近認識的惡性腫瘤。由于其臨床病理、免疫表型及遺傳學特征尚未被充分認識，因此極易誤診。2010年本課題組首次發(fā)現(xiàn)并報道了中國人t（6；11）染色體易位RCC病例，并利用光鏡、免疫組織化學、電鏡、PCR、RT-PCR及基因測序等方法對該腫瘤的形態(tài)學、免疫表型、超微結(jié)構(gòu)及遺傳學改變進行了研究，并提出了明確診斷及鑒別診斷該類腫瘤的方法［1］。在我國，這類RCC正越來越多地被人們所認識，其主要發(fā)生于兒童或青年人［2-3］。由于t（6；11）染色體易位，形成Alpha-TFEB融合基因，導致t（6；11）染色體易位RCC細胞核高表達TFEB蛋白［4-8］。Alpha基因無內(nèi)含子及RNA剪接位點，目前認為Alpha基因不編碼有功能的蛋白質(zhì)［9］，因此推測其在t（6；11）染色體易位RCC中可能作為啟動子而促進TFEB的表達。本研究從t（6；11）染色體易位RCC患者中擴增Alpha基因，構(gòu)建包含不同Alpha基因片段的重組報告質(zhì)粒和Alpha-TFEB融合基因表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞后分別行熒光素酶活性檢測和Western blot法確定Alpha基因啟動子活性，對深入研究t（6；11）染色體易位RCC的發(fā)病機制及治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

t（6；11）染色體易位RCC患者基因組的DNA由本研究室保存；人胚腎293T細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶SacⅠ、NcoⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶，DL2000、DL10000Marker、質(zhì)粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒均購自大連寶生物公司；DH5α感受態(tài)細菌購自北京天根生化科技公司；pGEM-T 載體、質(zhì)粒pGL3-Enhancer、pGL3-Control、pGL3-Basic、PRL-TK及熒光素酶檢測試劑盒均為美國Promega公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TFEB抗體（編號：sc-11005）和β-actin抗體（編號：sc-376421）購自美國Santa Cruz公司；含TFEB（編號：NM_007162）基因mRNA全長的真核表達質(zhì)粒購自上海吉凱基因公司；高保真PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；全波長酶標儀為美國BioTek Instruments公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Alpha基因啟動子區(qū)域的預測 本課題組前期研究結(jié)果顯示，t（6；11）染色體易位RCC患者基因組的DNA中可檢測到Alpha-TFEB融合基因，Alpha基因（GenBank No.AF203815）于1 810位核苷酸處斷裂后與TFEB基因融合［1］。利用在線啟動子預測軟件（www.genomatix.de）進行分析，將預測值0.80作為判斷的臨界值來預測融合基因中Alpha基因的啟動子（表1）。

表1 Alpha基因啟動子區(qū)域的預測結(jié)果Table 1 Promoter predictions for the Alpha gene

1.2.2 正常TFEB基因啟動子序列的確定 檢索EPD（eukaryotic promoter database）數(shù)據(jù)庫可知正常TFEB基因啟動子的序列為：ACTCTGGACTTTCTCTAATAA TAAATAGTTCTTCTTTATGTTGGTCATCCTGTTGTTT TTGGAAGGGAGTTTTCCCTGAGTGGCTACAAGGTTT CCTGGTGGGTCACTGTGATTCTAAGAGAAATGGGAC CTAAGGCATGGCTTGGGATGGGCTCTGTAACCCTCA GAGCTTAAAGTTCATACTTTTCCCCTGGAAAGGGAA GACAGTGGTAGCGCCATCATGGGTGGGTGGGTGGC GGGCCGGGGGAGAGTGTTCCTACTTGAGTCACAGAG AAATCGAGCCTATTTGCTGGAACCAACTCAGCAAG GGATCTTGTCCCTTTGGACTTCATCCCTGTCCTCCTC AGGAGCCTCTTAGCAAAAGATCCAGAAACCAGGAG CAACATTGTATGTGGGGAAGGAGGAGAGAGAGGAAG AAAAGGAGGAGGGGAAGGAGAAGAAAAGCAGGGGA GGGGCTGGGGGAGGAGACAGGGAAAAAGGGGCGG GGAAGAGGAGAAAGTAGAGAATGATGCCTCCGCACC CTGTGAACTTCCAACAAGGGAAGGTGACATGAAAG GAGCTCAGACAATTTCTGTCCAGCAACATGACAGCAA GCTCAGG。

1.2.3 PCR引物的設計 根據(jù)預測結(jié)果采用Primer 5.0軟件設計5對引物擴增5種不同片段長度的Alpha PCR產(chǎn)物，Alpha1（含 369～419、643～693、1 646～1 696）、Alpha2（含 643～693、1 646～1 696）、Alpha3（含 1 646～1 696）、Alpha4（含 369～419）和 Alpha5（含643～693）。設計1對引物擴增TFEB mRNA全長，1對引物擴增正常TFEB基因啟動子（pTFEB）。引物由上海英俊公司合成，序列見表2。

1.2.4 PCR擴增 以t（6；11）染色體易位RCC患者基因組的DNA為模板，利用Alpha基因5對引物，分別進行PCR擴增，步驟按照高保真PCR試劑盒說明書進行。PCR反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火溫度Alpha 1、2、4為55℃、Alpha3為52℃、Alpha5為58℃，退火時間為30 s，72℃延伸Alpha1為2 min、Alpha2為90 s、Alpha 3、4、5為30 s，均35個循環(huán)，72℃延伸10 min；以含TFEB mRNA全長的質(zhì)粒為模板，擴增獲得TFEB cDNA全長；以正常人DNA為模板擴增TFEB基因的啟動子（pTFEB）。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.5 TA克隆及鑒定 將PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠回收試劑盒進行純化，通過分光光度計檢測OD260/280計算純化后PCR產(chǎn)物的濃度和純度。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，取200 μL在含Amp/IPTG/X-Gal上鋪板，干燥5～10 min，37℃倒置培養(yǎng)18～24 h。從每塊平板中挑取2個無色菌落于含Amp液體的LB培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，7種質(zhì)粒分別標記為 Alpha1-T、Alpha2-T、Alpha3-T、Alpha4-T、Alpha5-T、TFEB-T、pTFEB-T，通過分光光度計檢測OD260/280計算質(zhì)粒的濃度和純度，由上海英俊公司完成測序。根據(jù)不同長度的片段各挑取1個序列正確的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。

1.2.6 pGL3-Enhancer-Alpha和pTFEB重組報告質(zhì)粒的構(gòu)建 采用DNA凝膠回收試劑盒回收從Alpha1-T、Alpha2-T、Alpha3-T、Alpha4-T、Alpha5-T、pTFEB-T質(zhì)粒上雙酶切得到的DNA片段，同時對pGL3-Enhancer載體進行雙酶切。采用DNA凝膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，將Alpha 1、Alpha 2、Alpha 3、Alpha 4、Alpha 5、pTFEB片段連接到pGL3-Enhancer載體，分別構(gòu)建pGL3-Enhancer-Alpha1、pGL3-Enhancer-Alpha2、 pGL3-Enhancer-Alpha3、 pGL3-Enhancer-Alpha4、pGL3-Enhancer-Alpha5和 pGL3-Enhancer-pTFEB質(zhì)粒。

1.2.7 pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB融合基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將測序正確的TFEB-T質(zhì)粒和pGL3-Enhancer-Alpha1雙酶切。采用DNA凝膠回收試劑盒分別回收TFEB片段和切除熒光素酶基因的pGL3-Enhancer-Alpha1質(zhì)粒骨架，將TFEB片段通過T4 DNA連接酶連接到pGL3-Enhancer-Alpha1質(zhì)粒骨架上，構(gòu)建以Alpha1為啟動子的融合基因表達質(zhì)粒pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB。

1.2.8 293T細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細胞。轉(zhuǎn)染24 h前，使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基傳代293T細胞，調(diào)整濃度至2×105/mL，96孔板中接種100 μL/孔；將1.5 μg的 pGL3-Enhancer-Alpha1、2、3、4、5、pTFEB 分別與300 ng的PRL-TK載體組和150 μL的DMEM混勻，pGL3-Control載體組作為陽性對照，pGL3-Basic載體組作為陰性對照，PRL-TK載體組為內(nèi)參；將30 μL的Lipofectamine 2000與750 μL的DMEM混勻，室溫靜置5 min；分別將150 μL稀釋的質(zhì)粒與150 μL稀釋的脂質(zhì)體溫和混勻，室溫孵育20 min；96孔板加入50 μL/孔混合物，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6個復孔，轉(zhuǎn)染實驗重復3次。按Lipofectamine 2000說明書將pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細胞，以pGL3-Enhancer質(zhì)粒作為對照。

1.2.9 Western blot法 轉(zhuǎn)染24 h后，換成常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取1×106/mL轉(zhuǎn)染后的細胞置于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心1 min。收集細胞沉淀，棄去液體，加入100 μL PBS重懸細胞，再加入2×SDS PAGE上樣緩沖液100 μL，沸水中作用5 min，10 000 r/min離心1 min。上樣緩沖液20 μL/孔進行SDS PAGE電泳，常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)膜和抗體孵育。一抗為TFEB抗體，β-actin抗體，二抗為羊抗鼠IgG-HRP，抗體孵育完成采用高靈敏度試劑盒進行發(fā)光，并在Tanon-5500 Multi成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）上進行觀察。

表2 PCR擴增及質(zhì)粒構(gòu)建中所用引物序列Table 2 Primer sequences for polymerase chain reaction amplification and plasmid construction

1.2.10 熒光素酶活性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，采用熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶的活性。取20 μL轉(zhuǎn)染細胞裂解液加入96孔板中，加入100 μL的LARⅡ，使用Bio Tek酶標儀在560 nm波長檢測螢火蟲熒光素酶的吸光值，再加入1×Stop&Glo?試劑100 μL，在465 nm波長檢測海腎熒光素酶的吸光值。以465 nm波長測定的吸光值作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異，獲得相對熒光信號的強度。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6個復孔，并重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

經(jīng)PCR擴增獲得不同長度的Alpha基因片段。PCR電泳產(chǎn)物顯示Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4和Alpha5不同長度的Alpha片段，大小分別為1 854、1 459、404、256和 139 bp。經(jīng) PCR 擴增分別獲得1 437 bp的全長TFEB cDNA和600 bp的pTFEB。

2.2 TA克隆的鑒定

TA克隆后獲得Alpha1-T、Alpha2-T、Alpha3-T、Alpha4-T和Alpha5-T質(zhì)粒，經(jīng)NcoⅠ和SacⅠ/HindⅢ/KpnⅠ雙酶切后，電泳可見相應插入的Alpha基因片段。上述5個質(zhì)粒經(jīng)測序確認，含Alpha基因片段的序列與GenBank中的序列一致。TFEB-T，pTFEB-T質(zhì)粒酶切后得到的序列與GenBank中的序列一致。

2.3 pGL3-Enhancer-Alpha和pTFEB重組報告質(zhì)粒的鑒定

重組報告質(zhì)粒pGL3-Enhancer-Alpha1、pGL3-E nhancer-Alpha2、pGL3-Enhancer-Alpha3、pGL3-Enhancer-Alpha4、pGL3-Enhancer-Alpha5經(jīng)雙酶切后均出現(xiàn)2條特異條帶，其中1條為pGL3-Enhancer載體，另1條為目的片段（圖1）。pGL3-Enhancer-pTFEB經(jīng)雙酶切后也出現(xiàn)兩條特異條帶（圖2）。表明含不同Alpha基因片段和pTFEB的重組報告質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

2.4 pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB融合基因表達質(zhì)粒的鑒定

融合基因表達質(zhì)粒pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB經(jīng)SacⅠ和NcoⅠ雙酶切后出現(xiàn)2條特異條帶，其中1條為pGL3-Enhancer-TFEB，另1條為Alpha1片段；經(jīng)NcoⅠ和XbaⅠ雙酶切后出現(xiàn)兩條特異條帶為pGL3-Enhancer-Alpha1和TFEB（圖3）。表明pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB融合基因表達質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

2.5 Western blot檢測pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB質(zhì)粒表達TFEB蛋白水平

與pGL3-Enhancer質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB表達質(zhì)粒組TFEB蛋白的表達明顯升高（圖4）。表明Alpha基因作為啟動子促進了TFEB的表達。

圖1 含不同Alpha基因片段重組報告質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 1 Enzyme identification of recombinant reporter plasmids containing different Alpha gene segments

圖2 含pTFEB重組報告質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 2 Identification of recombinant reporter plasmids containing pTFEB by enzyme digestion

圖3 pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB融合基因表達質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 3 Identification of recombinant expression plasmids containing fusion gene Alpha1-TFEB by enzyme digestion

圖4 Western blot檢測pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB質(zhì)粒表達TFEB蛋白水平Figure 4 TFEB expression of pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB in 293T cell detected by Western blot analysis

2.6 熒光素酶活性檢測Alpha基因片段的啟動子活性

與pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（113.00±53.05）比較，Alpha1（945.89±170.79）、Alpha2（966.56± 117.35）、Alpha3（752.89±147.22）、Alpha4（189.94±50.67）、Alpha5（1 042.28±166.54）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著增高（P＜0.01），而Alpha5的熒光素酶活性最高。與pTFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，Alpha1、Alpha2、Alpha5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著增高，而Alpha4的活性顯著降低（P＜0.01，圖5，表3）。可見，t（6；11）染色體易位RCC中Alpha基因具有啟動子活性，Alpha5片段最強活性區(qū)域位于643～693位堿基序列。

圖5 不同Alpha基因片段啟動子活性分析Figure 5 Promoter activity analysis of different Alpha gene segments

表3 不同Alpha基因片段啟動子活性分析Table 3 Promoter activity analysis of different Alpha gene segments

3 討論

t（6；11）染色體易位RCC的t（6；11）染色體易位使位于11號染色體的Alpha基因與6號染色體的TFEB基因發(fā)生融合，形成Alpha-TFEB融合基因，導致該類腫瘤細胞核高表達TFEB蛋白［4-8］。Alpha基因無內(nèi)含子及RNA剪接位點，編碼1個長7.5～8.5 kb的轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本內(nèi)不含長于55個氨基酸的開放讀碼框，其可能產(chǎn)生的肽類與任何已知的蛋白質(zhì)均不同源，目前認為Alpha基因不編碼有功能的蛋白質(zhì)［9-10］。Alpha基因是否作為啟動子促進TFEB的表達及Alpha基因最強活性區(qū)域存在位置，目前尚不清楚。

本研究利用在線啟動子預測軟件，對融合基因Alpha-TFEB中的Alpha基因序列進行啟動子預測。采用PCR方法從t（6；11）染色體易位RCC患者基因組的DNA中擴增出5種不同長度的Alpha基因片段，其中Alpha1為t（6；11）染色體易位RCC患者Alpha-TFEB融合基因中的全長Alpha基因［1］，將其與pGEM-T載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α。經(jīng)測序及雙酶切證明序列正確，然后構(gòu)建包含不同Alpha基因片段和含正常TFEB基因啟動子序列的重組報告質(zhì)粒，脂質(zhì)體分別瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞后，通過熒光素酶報告基因的表達來檢測所插入片段的啟動子活性。本研究結(jié)果顯示t（6；11）染色體易位RCC中Alpha基因具有啟動子活性，與Kuiper等［9］推測的一致。Alpha5片段最強活性區(qū)域位于643～693位堿基序列。

TFEB基因包含10個外顯子和9個內(nèi)含子，編碼長約2.3 kb的轉(zhuǎn)錄本。Alpha-TFEB融合轉(zhuǎn)錄本全長約3.5 kb，僅在t（6；11）染色體易位RCC中可檢測出，而在其他類型RCC或正常腎組織中均未檢測出，同時Northern blot法發(fā)現(xiàn)在正常腎組織中未檢測到TFEB轉(zhuǎn)錄本，但在t（6；11）染色體易位RCC中不僅可檢測到Alpha-TFEB融合轉(zhuǎn)錄本，也可檢測到TFEB轉(zhuǎn)錄本［9］。本研究為了進一步觀察融合基因Alpha-TFEB中的Alpha基因能否啟動TFEB的表達，模擬體內(nèi)的真實DNA架構(gòu)，構(gòu)建了pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB融合基因表達載體，其中Alpha1-TFEB融合基因全長約3.3 kb，轉(zhuǎn)染293T細胞后，通過Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后TFEB蛋白的表達水平，結(jié)果顯示TFEB蛋白表達明顯升高，提示Alpha基因作為啟動子促進了TFEB表達。

真核基因的啟動子位于調(diào)控基因表達的區(qū)域，啟動子分析是轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中十分常用的技術(shù)。目前已有多種腫瘤特異啟動子應用于腫瘤靶向治療之中［11-12］。本研究的結(jié)果為后續(xù)研究t（6；11）染色體易位RCC中Alpha基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制、Alpha-TFEB融合基因編碼產(chǎn)物TFEB對腫瘤細胞生物學行為影響及致瘤機制方面作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了包含不同Alpha基因片段的重組報告質(zhì)粒和Alpha-TFEB融合基因表達質(zhì)粒，利用熒光素酶活性檢測和Western blot法證實Alpha基因具有啟動子活性，能夠啟動TFEB的表達，并確定了最強的啟動子活性區(qū)域，為深入研究t（6；11）染色體易位RCC的發(fā)病機制及治療奠定了基礎(chǔ)。

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