miR-26a通過(guò)調(diào)節(jié)MTDH基因表達(dá)抑制CAOV3細(xì)胞系生長(zhǎng)

王淑芬，董巍蕾，謝 晶，何 璐，周 曦，蔡艷林，劉 杰，謝宛玉(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的內(nèi)源性小RNA分子，通過(guò)與靶基因非編碼區(qū)特異性堿基配對(duì)從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs靶向調(diào)控大量的mRNAs，通過(guò)與基靶基因的3′非編碼區(qū)相互結(jié)合，從而誘導(dǎo)mRNA降解或者抑制蛋白的翻譯[1-2]。研究表明，miR-26a存在于兩個(gè)染色體位點(diǎn)，miR-26a-1位于3號(hào)染色體，miR-26a-2位于12號(hào)染色體。目前有關(guān)miR-26a在腫瘤中的作用的研究報(bào)道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌患者生存時(shí)間及對(duì)干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)且能通過(guò)靶基因組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和致瘤性[4]。同時(shí)miR-26a在乳腺癌組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)，miR-26a模擬物能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。通過(guò)凋亡試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-26a能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[5]。miR-26a在肝癌、鼻咽癌、胃癌以及乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[3-5]。MTDH,又名AEG-1，在多種腫瘤如食管鱗癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、前列腺以及非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)[6-10]。Li C等[11]研究顯示，MTDH在晚期黏液性卵巢癌中高表達(dá)，并且與患者的預(yù)后差和對(duì)順鉑耐藥相關(guān)。目前對(duì)于miR-26a與MTDH在卵巢癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用qRT-PCR、Western blot以及MTT法檢測(cè)miR-26a在卵巢癌中的生物學(xué)作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2008年1月～2013年7月期間，本院收治確診卵巢癌患者52例。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何化療藥物治療，中位年齡53(39～70)歲。病理診斷結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理科醫(yī)生確認(rèn)，癌旁組織取自距癌組織5 cm以外。本次研究獲得南華大學(xué)附一醫(yī)院倫理組織批準(zhǔn)以及研究對(duì)象的知情同意。

1.2 細(xì)胞株

CAOV3為卵巢癌細(xì)胞株，由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)。

1.3 主要材料

miR-26a mimics及對(duì)照mimics購(gòu)自Ambion公司。MTDH siRNA質(zhì)粒購(gòu)自santa cruz公司。MTDH抗體和β-actin抗體購(gòu)自santa cruz公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PRIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。MTS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 qRT-PCR

取適量組織，用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為20 μL體系，包括：Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，miRNA RT product 2.0 μL，MiR-PCR primers(5 μmol/L)0.4 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為:95 °C ×3 min,95 °C ×12 s，62 °C ×35 s,72 °C ×30 s,共35 個(gè)循環(huán)。以U6 snRNA為內(nèi)參，所測(cè)定的miR-26a的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。檢測(cè)MTDH mRNA 方法同上，其引物序列正向：5′-TGGCAAATGTGGCCAACA-3′，反向： 5′-TATTAGGTAACCGACCCCCTCTT-3′，以β-actin為內(nèi)參，所測(cè)定的MTDH mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

1.5 Western blot

將miR-26a mimics 或MTDH siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。各組取等量樣本，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉，加入MTDH或GAPDH抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

取轉(zhuǎn)染后的CAOV3細(xì)胞，消化后接種細(xì)胞于96孔板中，每空5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基中作為調(diào)零孔。接種72 h后，每孔加20 μL MTS檢測(cè)試劑，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)吸光度值(OD492)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌及其相應(yīng)癌旁組織中miR-26a表達(dá)水平分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-26a在52例卵巢癌癌旁組織、癌組織中的表達(dá)分別為1.05±0.18、0.69±0.16，兩者相比，差異有顯著性(P<0.01，圖1A)；MTDH在52例卵巢癌癌旁組織、癌組織中的表達(dá)分別為1.11±0.21、3.49±0.54，兩者相比，差異具有顯著性(P<0.01，圖1B)。

圖1 miR-26a與MTDH在卵巢癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平的分析

2.2 miR-26a對(duì)卵巢癌CAOV3細(xì)胞中MTDH蛋白表達(dá)的影響

研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因[12]，為了明確miR-26a對(duì)MTDH的蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用，將miR-26a mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌CAOV3細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染miR-26a-control為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染MTDH siRNA為陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26a組和MTDH siRNA組MTDH蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯降低(圖2)。即miR-26a能下調(diào)卵巢癌CAOV3細(xì)胞系中MTDH蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖2 Western blot檢測(cè)miR-26a對(duì)MTDH蛋白的影響

2.3 miR-26a對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

分別將miR-26a-mimics，miR-26a-control(陰性對(duì)照組)和MTDH siRNA以及siRNA-control(陰性對(duì)照組)轉(zhuǎn)入CAOV3細(xì)胞24、48、72 h后，通過(guò)MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MTDH siRNA和miR-26a mimics組CAOV3細(xì)胞從48 h起增殖速度明顯減慢，與miR-26a control對(duì)照組細(xì)胞相比，差異均有顯著性(P<0.05，圖3)，高表達(dá)miR-26a通過(guò)下調(diào)MTDH的表達(dá)，從而抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

圖3 miR-26a與MTDH siRNA抑制CAOV3細(xì)胞增殖

2.4 在卵巢癌及其癌旁組織中miR-26a與MTDH的表達(dá)成負(fù)相關(guān)

經(jīng)SPSS 16.0軟件相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌及其癌旁組織中miR-26a與MTDH的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.043，P=0.032，差異具有顯著性(圖4)。

圖4 miR-26a與MTDH在卵巢癌及其癌旁組織中的相關(guān)性分析

3 討 論

卵巢癌在女性生殖腫瘤中的發(fā)病率居第六位，每年大約有230 000例新發(fā)病例[13]。卵巢癌的早期生存率很高，但是由于大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，而且大部分病人對(duì)目前的化療案產(chǎn)生耐藥，所以化療藥物對(duì)卵巢癌患者的治療成功率很低[13]。每年約有140 000位患者死于卵巢癌，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康[14]。這一狀況近十年來(lái)未能改善，卵巢癌生存率仍然很低，死亡率居各類婦科惡性腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅，迫切需要新的治療藥物提高卵巢癌的生存率。

miRNA是長(zhǎng)20-23nt的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因3′-非翻譯區(qū)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制基因的翻譯或降解mRNA發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能。目前，有上千的miRNA被發(fā)現(xiàn)，已證實(shí)許多miRNA參與了發(fā)育、分化、凋亡、增殖及細(xì)胞死亡等生物過(guò)程并發(fā)揮重要作用[1,15]。多個(gè)miRNA在腫瘤中表達(dá)失調(diào)。其可能的機(jī)制有：miRNA所在基因發(fā)生缺失、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控[2]。研究表明，miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因/抑癌基因的作用，調(diào)控腫瘤增殖、浸潤(rùn)、凋亡及耐藥性等功能[16]。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌患者生存時(shí)間及對(duì)干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)且能通過(guò)靶基因EZH2抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和致瘤性[4]。同時(shí)miR-26a能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[17]。然而目前關(guān)于miR-26a在卵巢中的研究報(bào)道尚少見(jiàn)，本研究通過(guò)對(duì)卵巢癌和癌旁組織中miR-26a的表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-26a在卵巢組織中表達(dá)明顯下調(diào)。研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因，且本研究通過(guò)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)MTDH是miR-26a調(diào)控的靶基因。MTDH最初在胎兒膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)HIV誘導(dǎo)的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)MTDH在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且通過(guò)PI3K-AKT,NF-κB,MAPK以及Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)過(guò)程[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)在CAOV3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-26a或干擾MTDH后能明顯抑制CAOV3細(xì)胞的增殖活力，表明miR-26a可能通過(guò)下調(diào)MTDH的表達(dá)，從而抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞的增殖。綜上所述，miR-26a在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)直接靶向調(diào)控MTDH的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用，本文繼續(xù)深入miR-26a在卵巢癌中的功能和分子研究，系統(tǒng)闡明miR-26a參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制，為卵巢癌的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

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