北亞熱帶區(qū)紅三葉自毒效應(yīng)潛勢初探

蔡 明，牟 蘭，張美艷，王宗禮，黃必志＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動 物科技學(xué)院，云南 昆 明650201；2.蘭州大學(xué) 草 地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭 州730020；3.云南省草地動物科學(xué)研究院，云南 昆 明650212）

紅三葉（Trifolium pratense L.）是世界上重要的豆科牧草之一，不但群落適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高而且莖葉柔軟，適口性好，蛋白質(zhì)含量占干物質(zhì)的25%以上，各類家畜都喜采食，對改善家畜肉品質(zhì)具有重要作用［1-3］。化感作用主要是指植物通過莖葉揮發(fā)、淋溶、根系分泌等途徑向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)并對其他植物或者自身產(chǎn)生促進(jìn)和抑制的作用［4-8］，是一種極其復(fù)雜的自然生態(tài)現(xiàn)象。紅三葉具有極強(qiáng)的化感作用，其會分泌出多種異黃酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)會從植物的不同部位釋放到環(huán)境當(dāng)中，對植物的生長發(fā)育起抑制作用，因此紅三葉常形成較強(qiáng)的群落，不但排擠其他牧草，而且對自身也有影響［5，7］。當(dāng)受體和供體屬于同一種植物時(shí)，所產(chǎn)生的抑制作用現(xiàn)象，稱為植物的自毒作用，它是植物種內(nèi)相互影響的方式之一，是一種特殊的化感作用。近年來，國內(nèi)有關(guān)水稻［9-10］、小麥［11-13］、甘蔗［14］、煙草［15］等植物化感作用的研究報(bào)道較多，而對紅三葉自毒作用的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以北亞熱帶區(qū)昆明小哨牧場廣泛栽培利用的小哨紅三葉（莖、葉、花）三個(gè)部位浸提液為處理，研究了其對自身種子發(fā)育的影響，通過生物檢測方法對紅三葉的自毒作用進(jìn)行了初步研究，確定其是否對自身種子發(fā)育具有自毒影響以及影響強(qiáng)度大小，以期為北亞熱帶地區(qū)建立優(yōu)化的紅三葉間作、混作、套種模式及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體植物為小哨紅三葉（Triflium pretense L.），于2013年8月初采集于云南省草地動物科學(xué)研究院小哨示范草場，此時(shí)紅三葉處于開花初期。受體種子為小哨紅三葉種子，于2012年采于小哨試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅三葉莖、葉、花收集及浸提液的制備 挖取營養(yǎng)生長期生長健壯的紅三葉新鮮植株，迅速分開植株莖、葉、花，刷干凈灰土，剔除枯黃葉和老枝干，剪切5 mm左右小段；處理好的莖、葉、花稱重后分別放入錐形瓶，按1 g鮮重材料：4 m L水的比例用無菌蒸餾水在18～20℃室溫下震蕩浸泡48 h，然后用3層滅菌紗布和雙層濾紙過濾，再用0.45 μm微孔濾膜過濾得到濃度為0.25 g／m L的浸提液母液。將母液分別用無菌蒸餾水稀釋為0.025 g／m L、0.05 g／m L、0.075 g／m L、0.1 g／m L、0.15 g／m L、0.20 g／m L濃度后保存于4℃冰箱。培養(yǎng)皿（Φ9 cm）和濾紙滅菌，每個(gè)培養(yǎng)皿鋪2層濾紙，分別加入5 m L各濃度浸提液，無菌蒸餾水為對照。

1.2.2 種子萌發(fā)進(jìn)行生物檢測 選擇顆粒飽滿、大小均勻的紅三葉種子用10%的 H2O2消毒5 min，再用無菌蒸餾水沖洗干凈，均勻排列于培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿50粒，上蓋，封口膜封好邊緣，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽。每日固定補(bǔ)充適量紅三葉水浸提液或無菌蒸餾水1次，每個(gè)處理3次重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)下胚軸長、幼根長和幼苗長。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

化感指數(shù) RI＝1-C／T（當(dāng)T≧C時(shí)）；RI＝T／C-1（當(dāng)T＜C時(shí)），上式中：C指對照值，T指處理值，RI＞0表示促進(jìn)作用，RI＜0表示抑制作用，RI絕對值的大小與化感作用強(qiáng)度一致。

用SPSS20.0進(jìn)行單因子方差分析（One-way ANOVA）和Duncan描述法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉莖浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，不同濃度的莖浸提液處理紅三葉種子，種子的下胚軸長、幼根長和幼苗長受到不同程度的促進(jìn)和抑制作用。其中：下胚軸在不同濃度處理下均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，0.15 g／m L濃度的莖浸提液促進(jìn)作用較大，化感指數(shù)為0.20，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.10 g／m L濃度處理下的下胚軸長差異顯著（P＜0.05）。不同濃度的莖浸提液對幼根和幼苗均產(chǎn)生不同程度的抑制作用，（0.025～0.20 g／m L）濃度下，隨著濃度增加，抑制作用不斷增強(qiáng)；最高濃度0.20 g／m L的對幼根的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.60，與對照差異極顯著，與0.15 g／m L差異不顯著（P＞0.05），而與其余濃度差異極顯著（P＜0.01）；最高濃度0.20 g／m L對幼苗的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.34，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與低濃度0.025 g／m L、0.050 g／m L差異極顯著（P＜0.01）。說明莖浸提液對幼根長的化感影響強(qiáng)度大于幼苗長。

表1 紅三葉莖浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 1 The effect of red clover stem extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

2.2 紅三葉葉浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

從表2可以看出，不同濃度的葉浸提液對紅三葉種子下胚軸長、幼根長和幼苗長產(chǎn)生了不同的影響，對下胚軸長均產(chǎn)生了促進(jìn)作用，而對幼根長和苗長產(chǎn)生了抑制作用。其中：0.10 g／m L對下胚軸長的促進(jìn)作用最大，化感指數(shù)是0.29，與對照差異極顯著，且與0.025 g／m L、0.050 g／m L差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的葉浸提液對幼根長均產(chǎn)生了抑制作用，（0.075～0.20 g／m L）濃度區(qū)間，抑制作用隨濃度的加大，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最大，化感指數(shù)為-0.69，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與除0.050 g／m L濃度的其余處理差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的葉浸提液對幼苗長均表現(xiàn)為不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）濃度區(qū)間，抑制作用隨著濃度的加大，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最大，化感指數(shù)為-0.39，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L、0.15g／m L濃度的幼苗影響差異極顯著（P＜0.01）。說明葉浸提液對幼根長的化感影響大于幼苗長。

表2 紅三葉葉浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 2 The effect of red clover leaf extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

2.3 花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

試驗(yàn)（表3）表明，不同濃度的花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長產(chǎn)生了不同影響，既有促進(jìn)作用又有抑制作用。其中：花浸提液對下胚軸長表現(xiàn)為促進(jìn)作用，最大濃度0.20 g／m L的促進(jìn)作用最明顯，化感指數(shù)為0.21，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與 0.15 g／m L 濃度差異顯著 （P＜0.05）；在（0.025～0.10 g／m L）濃度區(qū)間，隨著濃度的增加，促進(jìn)作用不斷加強(qiáng)。不同濃度的花浸提液對幼根長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.63，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.050 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L濃度下的幼根長差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的花浸提液對紅三葉幼苗長均產(chǎn)生了抑制影響，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.31，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025、0.050 g／m L濃度下的幼苗差異極顯著（P＜0.01）?；ń嵋簩τ赘L的化感影響大于幼苗長。

表3 紅三葉花浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 3 The effect of red clover flower extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

試驗(yàn)（表3）表明，不同濃度的花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長產(chǎn)生了不同影響，既有促進(jìn)作用又有抑制作用。其中：花浸提液對下胚軸長表現(xiàn)為促進(jìn)作用，最大濃度0.20 g／m L的促進(jìn)作用最明顯，化感指數(shù)為0.21，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與 0.15 g／m L 濃度差異顯著 （P＜0.05）；在（0.025～0.10 g／m L）濃度區(qū)間，隨著濃度的增加，促進(jìn)作用不斷加強(qiáng)。不同濃度的花浸提液對幼根長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.63，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.050 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L濃度下的幼根長差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的花浸提液對紅三葉幼苗長均產(chǎn)生了抑制影響，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強(qiáng)，化感指數(shù)為-0.31，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025、0.050 g／m L濃度下的幼苗差異極顯著（P＜0.01）?；ń嵋簩τ赘L的化感影響大于幼苗長。

3 討 論

本試驗(yàn)以紅三葉為供體材料，通過對其種子的科學(xué)生物檢測，統(tǒng)計(jì)分析不同部位浸提液對其種子下胚軸長、幼根長和幼苗長這三個(gè)指標(biāo)的化感作用，證實(shí)了紅三葉不同部位能夠產(chǎn)生多種自毒物質(zhì)影響自身種子生長發(fā)育。本研究表明，紅三葉具有自毒作用，與對照相比，不同濃度的紅三葉各部位（莖、葉、花）浸提液對其種子生長發(fā)育產(chǎn)生了不同程度的影響，既有促進(jìn)作用，又有抑制作用，與前人的研究結(jié)果一致［16-18］。關(guān)于植物不同部位浸提液不同濃度處理間的化感效應(yīng)差異的問題，本試驗(yàn)顯示只有當(dāng)浸提液處理濃度達(dá)到某一臨界點(diǎn)時(shí)，才會產(chǎn)生明顯的化感抑制作用，低于這一濃度時(shí)紅三葉不受損壞，且部分化感物質(zhì)會對其生長產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用，李志華等［17，19-20］的研究也得出了類似的結(jié)果。此外，試驗(yàn)結(jié)果還揭示了不同部位的浸提液對種子幼根和幼苗的化感作用表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)，莖浸提液在（0.025～0.20 g／m L）濃度下，隨著濃度增加，對幼根和幼苗抑制作用不斷增強(qiáng)，葉、花浸提液在（0.10～0.20 g／m L）濃度下均表現(xiàn)出此種濃度效應(yīng)現(xiàn)象。

紅三葉不同部位浸提液對下胚軸長產(chǎn)生了促進(jìn)作用，說明部分自毒物質(zhì)在一定濃度下會產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的效應(yīng)。本研究顯示，不同部位的浸提液的促進(jìn)作用強(qiáng)度不同，如莖浸提液0.15 g／m L對下胚軸長的促進(jìn)作用最大，而葉、花浸提液對下胚軸長的促進(jìn)作用最大的分別是0.10和0.20g／m L浸提液。這些差異顯然不單單是化感物質(zhì)濃度高低引起的，可能還與紅三葉不同部位分泌的自毒物質(zhì)種類差異有關(guān)。與下胚軸長所受浸提液促進(jìn)作用不同的是，幼根長和幼苗長均受到了不同程度的抑制作用，且幼根受抑作用較幼苗大。試驗(yàn)過程中，受抑作用大的種子不僅根毛減少，而且根部出現(xiàn)上翻的敗育現(xiàn)象，說明紅三葉浸提液中的自毒物質(zhì)是通過抑制根的發(fā)育，影響根部對營養(yǎng)和水分的吸收，從而抑制幼苗的生長，最終導(dǎo)致地上生物量下降。

植物種子萌發(fā)的過程是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，室內(nèi)試驗(yàn)條件和自然條件狀態(tài)是不同的，紅三葉在自然狀況下由于受到熱量、水分、土壤等因素的影響［21-22］，紅三葉的自毒作用強(qiáng)度也會有所不同，大部分化感物質(zhì)是要通過枯枝敗葉腐爛分解并經(jīng)過復(fù)雜的土壤轉(zhuǎn)化過程才逐步釋放的，故今后還需加強(qiáng)砂培試驗(yàn)，做進(jìn)一步研究。

［1］ 杜占池，樊江文，鐘華平.營養(yǎng)元素在紅三葉葉片分解過程中的釋放動態(tài)［J］.草業(yè)科學(xué)，2003，20（7）：12-15.

［2］ 王元素，洪紱曾，蔣文蘭，等.喀斯特地區(qū)紅三葉混播草地群落對長期適度放牧的響應(yīng)［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16（1）：117-124.

［3］ Brown H，Moot D，Pollock K.Herbage production，persistence，nutritive characteristics and water use of perennial forages grown over 6 years on a Wakanui silt loam［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，2005，48（4）：423-439.

［4］ 王大力，馬瑞霞.水稻化感種質(zhì)資源的初步研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（3）：94-96.

［5］ 孔垂華，徐 濤，胡 飛，等.環(huán)境脅迫下植物的化感作用及其誘導(dǎo)機(jī)制［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，20（5）：849-854.

［6］ Rice.Allelopathy［M］.New York：Academic Press，1974：166-179.

［7］ 李 博.生態(tài)學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2000：97-99.

［8］ 閻 飛，楊振明，韓麗梅.植物化感作用（Allelopathy）及其作用物的研究方法［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，20（4）：692-696.

［9］ 朱紅蓮，孔垂華，胡 飛，等.水稻種質(zhì)資源的化感潛力評價(jià)方法［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（7）：788-792.

［10］ 孔垂華，徐效華，胡 飛，等.以特征次生物質(zhì)為標(biāo)記評價(jià)水稻品種及單植株的化感潛力［J］.科學(xué)通報(bào)，2002，47（3）：203-206.

［11］ 林瑞余.小麥化感作用及其根際生態(tài)學(xué)研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

［12］ 李振高，李良謨，潘映華，等.小麥苗期根系分泌物對根際反硝化細(xì)菌的影響［J］.土壤學(xué)報(bào)，1995，32（4）：408-413.

［13］ 孫紅艷.小麥化感種質(zhì)資源評價(jià)及其遺傳多樣性研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

［14］ 張愛加，袁照年，陳冬梅，等.甘蔗根際土壤化感潛力評價(jià)及其化感物質(zhì)分析［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，18（5）：1 013-1 017.

［15］ 陳冬梅，黃錦文，柯文輝，等.連作煙草根際土壤化感潛力評價(jià)及化感物質(zhì)鑒定［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2012，18（1）：46-52.

［16］ 李志華，沈益新.紅三葉莖葉對幾種牧草種子及幼苗的化感作用［J］.中國草地，2005，27（3）：41-43，48.

［17］ 郭曉霞，沈益新，李志華.幾種豆科牧草地上部水浸提液對稗草種子和幼苗的化感效應(yīng)［J］.草地學(xué)報(bào)，2006，14（4）：356-359.

［18］ 李志華，沈益新，倪建華，等.豆科牧草化感作用初探［J］.草業(yè)科學(xué)，2002，19（8）：28-31.

［19］ 王 慧，周淑清，黃祖潔.狼毒對草木犀、多年生黑麥草的化感作用［J］.草地學(xué)報(bào)，2009，17（6）：826-829.

［20］ 朱旺生，沈益新.白三葉和高羊茅不同品種對蘿卜幼苗的化感作用［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：28-31.

［21］ 肖輝林，彭少麟，鄭煜基，等.植物化感物質(zhì)及化感潛力與土壤養(yǎng)分的相互影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（9）：1 747-1 750.

［22］ 李玉占，粱文舉，姜 勇.苜蓿根際土壤化感潛力的初步研究［J］.土壤通報(bào)，2004，35（6）：776-779.