局部應(yīng)用水蛭素對大鼠血管吻合模型術(shù)后血栓形成的觀測

胡 哲，張 靜，郭鵬年

（1.包頭醫(yī)學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

血管顯微外科成功的關(guān)鍵在于顯微血管吻合口通暢，吻合口局部血栓形成是導(dǎo)致通暢率低的主要原因之一[1-2]。目前臨床上常用的防治微血管吻合術(shù)后血栓形成的藥物有西藥中的肝素、低分子右旋糖酐、阿司匹林、潘生丁等，中藥中的丹參[3]、川芎[4]、水蛭[5]等。

潘浩等[6]認(rèn)為水蛭具有減少兔的股動靜脈吻合口血栓形成，提高遠(yuǎn)期通暢率的作用。但水蛭療法可能出現(xiàn)貧血、感染、敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，靜脈應(yīng)用水蛭素可能出現(xiàn)出血、過敏、致死等問題，且水蛭素的用量、用法、凝血指標(biāo)檢測等依然不確定?；谝陨蠁栴}，本研究制作了血管吻合模型，分別局部應(yīng)用生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液）、肝素溶液（62.5U/ml）、水蛭素溶液（1ATU/ml），并通過觀察不同時間點吻合血管的通暢率、吻合口組織形態(tài)學(xué)變化，評估血栓面積等方法來探討局部應(yīng)用水蛭素對微血管吻合術(shù)后血栓形成的影響，為水蛭素應(yīng)用于顯微外科血管吻合術(shù)提供實驗依據(jù)，從而為臨床提高顯微血管吻合口通暢率提供藥物支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠120只，均為雌性，體重200～240g，平均（210±11）g，從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購入。在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物實驗室飼養(yǎng)（室溫約22℃～24℃，每天喂食2～3次，自由飲水）。

1.2 動物模型制作

將Wistar大鼠統(tǒng)一編號，按完全隨機分組方法分為生理鹽水組、肝素組、水蛭素組，每組40只。全部用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，備皮后碘伏消毒手術(shù)野皮膚，在股內(nèi)側(cè)做一縱行切口（起自腹股溝韌帶中點，至股骨中下段），逐層分離組織，并游離出股動脈，暴露長度2cm，用兩個微血管夾（遠(yuǎn)近端相距1cm）阻斷股動脈，然后于中點處橫行切斷，修剪外膜。接著，生理鹽水組用0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：D11081304，規(guī)格：500ml/瓶）、肝素組用62.5 U/ml肝素溶液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1006108，規(guī)格2ml:12500單位/安瓿）、水蛭素組用1ATU/ml水蛭素溶液（廣西科康生物科技有限責(zé)任公司，批號：20110312，規(guī)格：30ATU/瓶）沖洗血管腔。再全部用11-0尼龍線做原位斷端縫合，吻合進(jìn)針時保證針尖與血管壁以垂直角度進(jìn)入，邊距、針距均勻一致，內(nèi)膜對合良好，一般前、后壁各3針，共6針，每針縫線打3道結(jié)。每個吻合口在吻合最后一針未打結(jié)之前，用注射器針頭向吻合口內(nèi)注入相應(yīng)溶液（生理鹽水組：0.9%氯化鈉注射液，肝素組：62.5U/ml肝素溶液，水蛭素組：1ATU/ml水蛭素溶液）至吻合口充盈為止，然后完成打結(jié)。吻合完成后，再向吻合斷端局部注射3ml相應(yīng)溶液（同上），觀察血管通血情況，血管通暢實驗確認(rèn)吻合成功。用1號慕絲線關(guān)閉傷口，同法處理另一側(cè)股動脈。手術(shù)完畢后，將大鼠置于單籠飼養(yǎng)，自由活動。保持飼養(yǎng)室溫度為23℃。

1.3 觀察血管通暢情況

分別于術(shù)后2小時、24小時、3天、5天4個時間點從每個實驗組取10只大鼠，打開切口，顯露吻合后的血管（每組每個時間點兩側(cè)股動脈共20條血管），觀察血管吻合后的通暢情況。

1.4 組織學(xué)觀察及圖像分析

于術(shù)后4個時間點行大體觀察后將吻合血管段取出（長約1cm），經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)5μm切片，HE染色，脫水，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，取相當(dāng)于血管血栓體部中點的切片，用ImageProPlus6.0醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)測量血栓比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果以（±s）表示，3組間通暢率比較用行×列表χ2檢驗，3組間血栓比值比較用F檢驗和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察及血管通暢率

術(shù)后2小時，血管與周圍組織無粘連，吻合口有輕度水腫，無血塊黏附于血管壁，血管腔無狹窄，吻合血管通暢率均為100%，3組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 術(shù)后2 小時3 組間血管通暢情況比較

術(shù)后24小時，血管與周圍組織發(fā)生輕度粘連，大部分吻合口通暢，吻合口處外壁稍隆起，血管無狹窄。部分血管吻合口附近壁內(nèi)可見血凝塊，遠(yuǎn)端血流量小，流速慢，血管通暢實驗呈弱陽性，遠(yuǎn)端血管變細(xì)。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進(jìn)行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表2。

表2 術(shù)后24 小時3 組間血管通暢情況比較

術(shù)后3天，血管內(nèi)無血塊，栓塞血管可見血凝塊附著壁內(nèi)，遠(yuǎn)端血管內(nèi)無血液流動，血管通暢實驗呈陽性，血管蒼白。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進(jìn)行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表3。

表3 術(shù)后3 天3 組間血管通暢情況比較

術(shù)后5天，血管粘連加重，不易游離。縫線部分可見，栓塞血管可見血凝塊附著壁內(nèi)，血管通暢實驗呈陽性，管腔變細(xì)。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進(jìn)行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表4。

表4 術(shù)后5 天3 組間血管通暢情況比較

2.2 組織學(xué)觀察及圖像分析

可見內(nèi)皮細(xì)胞損傷性改變，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、部分脫落，中膜層平滑肌細(xì)胞變性壞死，外膜纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，中性白細(xì)胞浸潤隨時間延長呈減弱趨勢。

各組血栓吻合口內(nèi)可見血栓形成，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，中層纖維組織增生，各組間在組織上的病變差別不大（P＞0.05）。

術(shù)后2小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%，肝素組和水蛭素組血栓比值低于生理鹽水組（P<0.05），肝素組和水蛭素組之間比較，無顯著性差異（P>0.05）。

術(shù)后24小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，肝素組、水蛭素組、生理鹽水組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01）。

術(shù)后3天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，生理鹽水組、肝素組和水蛭素組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01）。

術(shù)后5天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，生理鹽水組、肝素組和水蛭素組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01），見表5。

表5 術(shù)后不同時間3 組間血栓比值（±s，%）

表5 術(shù)后不同時間3 組間血栓比值（±s，%）

注：與生理鹽水組比較，▲P＜0．05；與生理鹽水組比較，★P＜0．01；與肝素組比較，■P＜0．01

2小時血栓比值24小時血栓比值3天血栓比值5天血栓比值生理鹽水組 肝素組 水蛭素組3.32±1.16 8.21±1.55 11.27±3.21 13.47±2.91 1.22±0.87▲3.51±1.08★■4.56±1.88★■6.35±1.78★■1.13±0.75▲5.23±1.28★7.13±2.14★9.34±2.04★

3 討論

3.1 運用水蛭素的臨床意義

人類應(yīng)用水蛭治療疾病可以追溯到距今3500多年前[7-10]。水蛭入藥在我國最早記載于東漢時期的藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今也有2000多年的歷史。我國中醫(yī)認(rèn)為水蛭具有破血逐淤通經(jīng)的功效，主要用于治療血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、跌打損傷。薛鳳等[11]將單味中藥水蛭制成粉狀，口服治療高黏血癥患者30例，其血脂、血黏度、血小板的降低及臨床癥狀的改善均優(yōu)于阿司匹林組（P＜0.05）。

3.2 血管吻合后通暢率的比較

3組血管吻合后通暢率均隨著時間延長逐漸下降。術(shù)后2小時，3組通暢率均為100%；術(shù)后24小時，生理鹽水組為85%，肝素組為90%，水蛭素組為95%；術(shù)后3天，生理鹽水組為80%，肝素組為90%，水蛭素組為90%；術(shù)后5天，生理鹽水組為80%，肝素組為85%，水蛭素組為90%。這與血栓形成的規(guī)律較為符合。術(shù)后24小時、3天、5天，肝素組和水蛭素組通暢率均高于生理鹽水組，但進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析后，顯示3組間血管的通暢率比較，無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于每組每個時間點的實驗樣本量較?。?0條血管）的原因造成。

3.3 血栓比值

行組織形態(tài)學(xué)檢查，3組血管血栓比值隨時間延長而逐漸增大。術(shù)后2小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%；術(shù)后24小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%；術(shù)后3天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%；術(shù)后5天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%。這一規(guī)律與陳鐵軍等[12]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，在術(shù)后2小時、24小時、3天和5天時，肝素組與水蛭素組的血管通暢率比較，無顯著性差異（P＞0.05），但后3個時間點3組間血栓比值兩兩比較，有顯著性差異（P＜0.01）。說明當(dāng)有少量血栓形成時，可能對血管的通暢率無明顯影響。本研究僅觀察了血管吻合后早期的血管通暢情況，但其遠(yuǎn)期效果如何以及能否保持相對的穩(wěn)定，還有待深入研究。

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