食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌KLF4 SP1及Cyclin D1表達(dá)的對(duì)比研究*

崔晉峰 趙晨燕 曹立勇 吳文新 李月紅 王 媛 薛麗英 張祥宏

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤。國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為胃竇是胃癌的最常見(jiàn)的發(fā)生部位，賁門(mén)次之。但是過(guò)去的幾十年中，歐美國(guó)家的消化道惡性腫瘤類(lèi)型和發(fā)生部位發(fā)生了明顯的變化：一是組織學(xué)類(lèi)型上，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率下降而食管腺癌的發(fā)生率上升；二是從腫瘤發(fā)生部位上，胃遠(yuǎn)端（胃竇部）胃癌發(fā)生率下降，而食管胃交界腺癌的發(fā)生率出現(xiàn)驚人的上升趨勢(shì)［1］，有關(guān)食管胃交界腺癌（adenocarcinoma of the esphagogastric juntion，AEG）的問(wèn)題引起了國(guó)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，越來(lái)越多的研究顯示賁門(mén)腺癌與遠(yuǎn)端胃癌（distal gastric cancer，DGC）明顯不同，但卻與食管遠(yuǎn)端腺癌有許多相似之處，因此，學(xué)術(shù)界都傾向?qū)⑹彻芪附唤缦侔┝袨橐华?dú)立類(lèi)型的腫瘤。

本研究前期對(duì)河北省胃癌高發(fā)區(qū)（贊皇縣）和食管癌高發(fā)區(qū)（磁縣）兩個(gè)地區(qū)居民近十四年4 334例胃癌的發(fā)病情況進(jìn)行了系統(tǒng)性回顧分析，發(fā)現(xiàn)賁門(mén)癌在胃癌中所占的比例呈逐年增高的趨勢(shì)［2］，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。我們前期初步發(fā)現(xiàn)CK，MUC等分子以及p14ARF-Mdm2-p53信號(hào)通路在賁門(mén)腺癌和遠(yuǎn)端胃腺癌中的表達(dá)有著明顯的差異，這一發(fā)現(xiàn)提示賁門(mén)腺癌與遠(yuǎn)端胃腺癌可能在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中存在一定的差異［3-4］。

SP1（specificity protein 1）/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子（Krüppel like factor，KLF）家族，是一組鋅指蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。KLF4是KLF家族成員之一，能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SP1的GC結(jié)合位點(diǎn)而抑制其下游基因的表達(dá)。研究認(rèn)為KLF4和SP1的異常表達(dá)與與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）是一種原癌基因，被認(rèn)為是SP1的下游目的基因之一［6］。目前，有關(guān)KLF4，SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌及遠(yuǎn)端胃癌中表達(dá)情況的對(duì)比研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選取食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌病例，利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)KLF4、SP1和Cyclin D1的表達(dá)情況及其相互之間的關(guān)系，以期揭示食管胃交界腺癌與遠(yuǎn)端胃癌生物學(xué)行為的差異，為胃癌的合理防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2004年2月至2006年3月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科和磁縣縣醫(yī)院病理科存檔蠟塊，所有病理資料完整。對(duì)全部病例的所有蠟塊重新切片，行HE染色，由兩位高年資深病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)查。診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)WHO（2000年）提出的標(biāo)準(zhǔn)，將瘤體穿過(guò)食管胃鱗柱交界處的腺癌定義為食管胃交界腺癌，按照Siewert分型本組病例均為Ⅱ型。

按照腫瘤發(fā)生部位本組包括食管胃交界腺癌58例，其中高中分化腺癌24例，低分化腺癌及黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌34例。遠(yuǎn)端胃癌47例，其中高中分化腺癌30例，低分化腺癌及黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌17例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗KLF4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，鼠抗SP1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，兔抗Cyclin D1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 取經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋的蠟塊，5 μm；連續(xù)切片，60℃烤片1 h后經(jīng)二甲苯連續(xù)脫蠟3次，梯度乙醇水化，然后采用免疫組織化學(xué)SP法，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行，采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 KLF4蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞漿，細(xì)胞核也可有少量著色；SP1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核；Cyclin D1蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核和/或胞漿。以蛋白表達(dá)定位區(qū)出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊為染色陽(yáng)性，全面觀察切片后，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，≤10%計(jì)為（-），＞10%計(jì)為（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率計(jì)算法及Spearman相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF4在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)情況

KLF4陽(yáng)性反應(yīng)定位于胞漿，細(xì)胞核中有少量表達(dá)。在食管胃交界腺癌及遠(yuǎn)端胃癌組織的胞漿和/或細(xì)胞核中可見(jiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊的陽(yáng)性表達(dá)（圖1A，D）。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，KLF4在食管胃交界腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于遠(yuǎn)端胃癌（70%vs.42.6%，P＜0.05，表1）。對(duì)食管胃交界腺癌與遠(yuǎn)端胃癌之間相同分化程度中KLF4的表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在高中分化食管胃交界腺癌中KLF4的陽(yáng)性表達(dá)率高于高中分化遠(yuǎn)端胃癌（P＜0.05）；而且在低分化組中這種差異同樣存在（表2）。結(jié)果提示KLF4作為一種腫瘤抑制因子，其在遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生中發(fā)揮更重要的作用。

2.2 SP1在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)情況

SP1陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核。在食管胃交界腺癌及遠(yuǎn)端胃癌組織的細(xì)胞核中可見(jiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊的陽(yáng)性表達(dá)（圖1B，E）。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SP1在食管胃交界腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于遠(yuǎn)端胃癌（40.0%vs.68.1%，P＜0.05，表1）。另外，結(jié)果還顯示，SP1在食管胃交界腺癌高中分化組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于遠(yuǎn)端胃癌高中分化組（P＜0.05，表2）；但在低分化組中的陽(yáng)性表達(dá)率兩個(gè)部位胃癌之間未見(jiàn)明顯差異。結(jié)果提示SP1的高表達(dá)可能與遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生有關(guān)。

2.3 Cyclin D1在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)情況

Cyclin D1陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核和/或胞漿。在食管胃交界腺癌及遠(yuǎn)端胃癌組織的細(xì)胞核和/或胞漿中可見(jiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊的陽(yáng)性表達(dá)（圖1C，F(xiàn)）。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Cyclin D1在食管胃交界腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與遠(yuǎn)端胃癌相比未見(jiàn)明顯差異（表1）。同時(shí)，在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌的高中分化和低分化組之間Cyclin D1的表達(dá)也未見(jiàn)明顯差異（表2）。

2.4 食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在58例食管胃交界腺癌組中KLF4和SP1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。而Cyclin D1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率低于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（22.7%vs.58.3%，P＜0.05，表3）。

在47例遠(yuǎn)端胃癌組中KLF4在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率明顯高于在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（63.2%vs.28.6%，P＜0.05）。SP1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率低于在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（47.4%vs.82.1%，P＜0.05）。Cyclin D1在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率低于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（26.3%vs.57.1%，P＜0.05，表3）。

2.5 食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1蛋白表達(dá)的相互關(guān)系

在食管胃交界腺癌中KLF4與SP1和Cyclin D1之間未見(jiàn)明顯相關(guān)關(guān)系。在遠(yuǎn)端胃癌中KLF4與SP1（r=-0.334，P=0.022）及 KLF4 與 Cyclin D1（r=-0.341，P=0.019）呈負(fù)相關(guān)；SP1與Cyclin D1呈正相關(guān)（r=0.340，P=0.019）。

圖1 KLF4、SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)情況 （SP×400）Figure1 Positive staining of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach（SP×400）

表1 KLF4、SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)Table1 Expression of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach

表2 KLF4、SP1和Cyclin D1在高中分化和低分化腺癌中的表達(dá)情況Table2 Expression of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in well-or moderately differentiated cases and poorly differentiated cases

表3 食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table3 The relationship of KLF4，SP1，and Cyclin D1 expression with lymph node metastasis in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach

3 討論

近年來(lái)，有關(guān)胃癌發(fā)生部位變化及其可能機(jī)制的研究已經(jīng)成為胃癌研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。近期研究提示胃食管交界腺癌可能是胃癌的一種特殊類(lèi)型，其在危險(xiǎn)因素、腫瘤特征及生物學(xué)行為方面與遠(yuǎn)端胃癌存在一定差異。Cho等［7］對(duì)比分析了一組韓國(guó)賁門(mén)腺癌和非賁門(mén)腺癌患者肥胖發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)肥胖更多見(jiàn)于賁門(mén)腺癌患者，體重指數(shù)BMI是賁門(mén)腺癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Yang等［8］從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度研究了賁門(mén)腺癌的發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)mTOR/4E-BP1通過(guò)激活mTOR參與了賁門(mén)腺癌發(fā)生。Xu等［9］對(duì)比研究了賁門(mén)腺癌和遠(yuǎn)端胃癌遺傳改變的發(fā)生情況，結(jié)果提示從總的雜合性丟失率上兩個(gè)部位腫瘤無(wú)明顯差異，但丟失類(lèi)型上兩組有顯著不同。因此探討賁門(mén)腺癌和遠(yuǎn)端胃癌發(fā)生機(jī)制的差異可以為胃癌的合理防治提供科學(xué)依據(jù)。

KLF4是KLF因子家族成員之一，存在于胃腸道和上皮組織中，在細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)控中扮演作用角色。研究發(fā)現(xiàn)在特定的細(xì)胞微環(huán)境下，KLF4既可以作為腫瘤抑制因子又可以作為癌基因。Li等［10］研究發(fā)現(xiàn)KLF4的表達(dá)缺失可以促進(jìn)皮膚癌的發(fā)生；Patel等［11］研究認(rèn)為KLF4作為腫瘤抑制因子參與了結(jié)腸癌的發(fā)生；而Pandya等［12］則發(fā)現(xiàn)KLF4的高表達(dá)和乳腺癌的分化程度以及轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前越來(lái)越多的研究認(rèn)為KLF4在胃腸道是作為一個(gè)腫瘤抑制因子［13］。在本研究中發(fā)現(xiàn)KLF4在遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)明顯低于食管胃交界腺癌，而且隨著分化程度的降低KLF4的表達(dá)也逐漸減少。結(jié)果提示食管胃交界腺癌發(fā)生的分子機(jī)制有別于遠(yuǎn)端胃癌，KLF4的表達(dá)降低與遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生關(guān)系更為密切。

SP1和KLF4同屬于SP1/KLF4家族，都是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。SP1可以通過(guò)調(diào)控富含GC序列啟動(dòng)子的基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控癌基因、抑癌基因以及細(xì)胞周期、凋亡等相關(guān)分子。SP1在胃癌、胰腺癌、乳腺癌和及甲狀腺腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)；抑制SP1的活性可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。目前SP1被認(rèn)為是一個(gè)促癌蛋白前SPI被認(rèn)為是一個(gè)促癌蛋白［14］。本研究發(fā)現(xiàn)SP1在遠(yuǎn)端胃癌中的表達(dá)明顯高于食管胃交界腺癌；而且這一差異在高中分化組中更加明顯。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)食管胃交界腺癌與遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生機(jī)制是不同的，而SP1則與遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生關(guān)系更為密切。

細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）是一種原癌基因，可以與CDK4結(jié)合，磷酸化Rb，進(jìn)而啟動(dòng)S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。Cyclin D1表達(dá)失控時(shí)將引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，細(xì)胞失控性生長(zhǎng)形成腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)在食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌中Cyclin D1的表達(dá)無(wú)明顯差異。提示Cyclin D1并不是食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌發(fā)生機(jī)制差異性的關(guān)鍵分子。

KLF4和SP1在C-端的三個(gè)鋅指基因結(jié)構(gòu)具有高度同源性，KLF4能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SP1的GC盒結(jié)合位點(diǎn)而抑制下游基因的表達(dá)。如果KLF4和SP1之間的平衡被打亂，細(xì)胞會(huì)發(fā)生癌變。Kanai等［15］研究發(fā)現(xiàn)KLF4的表達(dá)缺失和SP1的過(guò)表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生。目前Cyclin D1被認(rèn)為是KLF4的下游目的基因之一，KLF4對(duì)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用部分是通過(guò)與Cyclin D1啟動(dòng)子的SP1結(jié)合區(qū)域相互作用介導(dǎo)的。Shie等［16］發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中SP1過(guò)表達(dá)能使KLF4對(duì)Cyclin D1啟動(dòng)子活性的抑制作用完全消失，從而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管胃交界腺癌中Cyclin D1蛋白的表達(dá)比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯增多；但是KLF4與SP1和Cyclin D1之間未見(jiàn)明顯相關(guān)關(guān)系。提示Cyclin D1可能參與了食管胃交界腺癌的轉(zhuǎn)移，但可能并非由KLF4與SP1介導(dǎo)的。而在遠(yuǎn)端胃癌中KLF4蛋白在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)明顯減少；SP1蛋白在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中表達(dá)增多；Cyclin D1蛋白在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中表達(dá)增多。而且在遠(yuǎn)端胃癌中KLF4與SP1和Cy-clin D1之間均呈負(fù)相關(guān)，這與Wei等［17］的研究結(jié)果一致。以上結(jié)果提示KLF4、SP1和Cyclin D1可能共同參與了遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能為KLF4和SP1的表達(dá)異常共同影響了其下游基因Cyclin D1的蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。

綜合以上研究結(jié)果，本研究認(rèn)為食管胃交界腺癌可以作為是一種獨(dú)立的類(lèi)型，其發(fā)生機(jī)制有別于遠(yuǎn)端胃癌。

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