浸潤性尿路膀胱上皮癌中人類表皮生長因子受體-2表達(dá)與擴(kuò)增的研究*

秦海明 金 慶 程 琳 宋福林 崔 彤

人類表皮生長因子受體-2（HER2）受內(nèi)源性酪氨酸激酶調(diào)控，控制生理性細(xì)胞增殖。對于HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)可評價乳腺癌的預(yù)后以及預(yù)測靶向治療的反應(yīng)［1-4］。在乳腺癌中，HER2基因的擴(kuò)增達(dá)到20.8%［2］，并且與HER2蛋白表達(dá)有良好的相關(guān)性。

研究顯示，在浸潤性膀胱癌（UBC）中也可以出現(xiàn)HER2的擴(kuò)增和/或過表達(dá)。然而，不同研究顯示的數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大差距，過表達(dá)從23%～80%，擴(kuò)增從0～32%不等［5-7］。也有研究顯示，膀胱癌與HER2基因狀態(tài)無關(guān)，而與17號染色體多倍體狀態(tài)有關(guān)［8］。因為國內(nèi)分子病理水平相對滯后，大多臨床數(shù)據(jù)均采用國外資料，但隨著研究的深入，不同基因在不同人種間可以出現(xiàn)較大差異。例如肺腺癌患者EGFR突變率亞洲和非亞洲患者分別為61%和25%［9］。HER2基因在膀胱癌中作用機(jī)制的研究相對較少，本實(shí)驗分析不同分期的UBC中HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增狀態(tài)，探討膀胱癌中抗HER2靶向藥物應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本選擇 沈陽軍醫(yī)總醫(yī)院2012年5月至2013年6月，診斷為UBC的患者49例，平均年齡68.80歲，其中男性38例，平均年齡66.55歲，女性11例，平均年齡69.91歲。診斷為T2期24例，T3期17例，T4期8例

1.1.2 試劑 HER2抗體：Roche診斷公司，VENTANA anti-HER2/neu（4B5）Rabbit Monoclonal Primary Antibady，批號：C10711。評分采用強(qiáng)度和染色百分比進(jìn)行半定量評分0～3+。僅對具有浸潤性成分進(jìn)行分析。HER2探針：Abbott Molecular Inc公司，PATH VYSION乳腺癌HER-2基因檢測試劑盒（FISH法）（02J01-030），批號439387。預(yù)處理試劑Vysis Paraffin Pretreatment Reagent KitⅡ，批號：439970。

1.1.3 儀器 Roche BenchMark XT全自動免疫組織化學(xué)染色儀，ThermoBrite AtatSpin原位雜交儀，OLYMPUS BX51熒光顯微鏡，QIMAGING MicroPublisher 5.0 RTV數(shù)碼攝像頭。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟至水，放入Roche BenchMark XT全自動免疫組織化學(xué)染色儀，按設(shè)定程序染色，修復(fù)溫度95℃8 min，100℃4 min，Primary Antiboby 20 min，2抗HRP UNIV MULT 8 min，顯色DAB+H2O28 min。程序結(jié)束后取出，封片，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)按照乳腺癌標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 FISH染色 切片脫蠟至水，風(fēng)干；置80℃預(yù)處理液中20 min，超純水3 min；置于蛋白酶溶液中37℃ 15 min，超純水3 min，風(fēng)干；70%乙醇1 min，85%乙醇1 min，100%乙醇1 min，風(fēng)干；加10 μL的Path Vysion探針混合液至雜交區(qū)，迅速蓋上蓋玻片，封膠；83℃表性5 min，37℃雜交過夜；挪去樹膠，放入室溫的雜交后洗液（2×SSC/0.3%NP-40）浸泡，除去蓋玻片；將切片放入73±1℃裝有雜交后洗液的Coplin染色缸中，輕輕晃動1～3 s，漂洗2 min；在暗處風(fēng)干，加入10 μL DAPI復(fù)染15 min，暗處避光保存，用熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用t檢驗和χ2檢驗進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分期與性別比較

49例UBC患者以男性居多，其中男性38例，女性11例，差異明顯。分期與性別分布見表1。

2.2 HER2蛋白表達(dá)及FISH檢測HER2基因

UBC分期患者HER2蛋白過表達(dá)（2+或3+）的占53.06%，其中2+占28.57%，3+占24.49%。其中T4的100.00%過表達(dá)，T364.71%過表達(dá)，T2有29.17%過表達(dá)，各分期之間表達(dá)強(qiáng)度有明顯差異性（P＜0.01，圖1）。

FISH檢測結(jié)果顯示，49例樣本均未出現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增，但有12例患者出現(xiàn)了17號染色體多倍體的情況，但各分期間無顯著性差異（P＞0.05，圖2）。

表1 HER2蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及FISH檢測HER2基因擴(kuò)增情況Table1 Results of Her2 protein by immunohistochemical staining and gene amplification by FISH

圖1 UBC患者HER2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （DAB×200）Figure1 HER2 immunohistochemical staining results in UBC patients（DAB×200）

圖2 UBC患者HER2基因擴(kuò)增檢測結(jié)果 （FISH×1000）Figure2 Results of Her2 gene amplification(FISH method)in UBC patients（FISH×1 000）

3 討論

患膀胱癌的性別差異是顯而易見的，男性患者明顯高于女性患者。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，這一現(xiàn)象與吸煙及工業(yè)化學(xué)物質(zhì)接觸有關(guān)。有研究顯示，膀胱癌的發(fā)生與雄激素受體信號通路有關(guān)。

在多種癌癥中HER2蛋白過表達(dá)及HER2基因擴(kuò)增是重要的影響預(yù)后的因素，特別是在導(dǎo)管內(nèi)乳腺癌，其與預(yù)后不良高度相關(guān)。重組人源化單克隆抗體—曲妥珠單抗的出現(xiàn)，對乳腺癌的治療產(chǎn)生了巨大的影響［10］。乳腺癌中大約有20.08%的患者出現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增。但是，IHC和FISH均不能反應(yīng)總的HER2蛋白水平，或許進(jìn)一步檢測活化/磷酸化HER2可以獲得與檢測總HER2蛋白量同樣的效果，使更多的患者受益［11］。在UBC中檢測到HER2的蛋白質(zhì)過表達(dá)或基因擴(kuò)增，但檢測數(shù)據(jù)顯示了較大的差異，有23%～80%的蛋白質(zhì)過表達(dá)，0～32%的基因擴(kuò)增，且數(shù)據(jù)大多來自國外。應(yīng)該積累國內(nèi)的有效數(shù)據(jù)，為患者提供有效的治療方法，而不是單純地追求新的藥物應(yīng)用。關(guān)于HER2蛋白在膀胱癌中的作用研究仍是不很多。但可以發(fā)現(xiàn)HER2蛋白在膀胱癌中有一定量的過表達(dá)。

研究顯示，用羅氏4B5 HER2抗體檢測的膀胱癌中，HER2蛋白顯示較強(qiáng)的過表達(dá)，其中T4期，100%顯示2+～3+，即使T2期中2+～3+也達(dá)到29.17%，過表達(dá)狀況顯著。并且陽性強(qiáng)度與浸潤性相關(guān)。在實(shí)際使用中，羅氏4B5HER2抗體較其它公司的抗體確實(shí)存在染色過強(qiáng)的現(xiàn)象。對于膀胱癌的染色尚需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

然而，經(jīng)FISH檢測HER2基因均未出現(xiàn)擴(kuò)增的狀況，但出現(xiàn)一定程度的17號染色體多倍體的情況。以前的研究也顯示，即使在高分期膀胱癌中HER2基因擴(kuò)增也較少見，并且與HER2蛋白的表達(dá)無相關(guān)性［13］，這與乳腺癌差別較大有關(guān)。此外，HER2的過度表達(dá)并沒有相關(guān)的基因擴(kuò)增，說明其它的轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄機(jī)制參與并調(diào)節(jié)了蛋白的表達(dá)?；蛟SHER2基因的突變會比基因擴(kuò)增產(chǎn)生更大的影響［12］。

另外，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)17號染色體倍數(shù)與膀胱癌分期有相關(guān)性，17號染色體多倍體發(fā)生膀胱癌的分期高，并易出現(xiàn)浸潤性［14］。也有研究顯示，17號染色體多倍體患者的預(yù)后較差［15］。17號染色體的多倍體可以通過結(jié)合形態(tài)學(xué)，更好的預(yù)測膀胱癌的侵襲傾向。

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