氫生理鹽水對大鼠缺血再灌注肝細胞線粒體功能的保護作用

李寶山 劉 渠 李 強

線粒體是氧化反應的主要場所，也是介導細胞凋亡的發(fā)源地。氧化呼吸鏈在線粒體中產(chǎn)生了大量的氧自由基，一旦體內(nèi)的氧化還原平衡被打破，線粒體產(chǎn)生的氧自由基便會首先損傷線粒體內(nèi)膜，導致線粒體滲透性的增加及各種效應因子的釋放，進而引起肝細胞的凋亡及壞死［1］。缺血再灌注（ischemia/reperfusion I/R）時，氧自由基在肝細胞內(nèi)大量聚積，氧自由基對肝細胞內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能有明顯損害作用，線粒體也是缺血再灌注肝細胞內(nèi)最先損傷的細胞器［2-3］。

介于氫分子小且呈電中性，很容易擴散，能輕易地穿過細胞膜及細胞器膜到達線粒體產(chǎn)生抗氧化效應［4］，而且本研究已經(jīng)證實氫生理鹽水（hydrogen-rich saline，HS）對缺血再灌注肝功能損傷有著明確的保護作用，旨在進一步研究HS對缺血再灌注大鼠肝細胞線粒體功能及氧化損傷保護作用，為肝臟手術中不可避免的缺血再灌注手術提供一種有效的輔助治療手段，也可為HS的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

實驗動物采用S-D大鼠（由天津醫(yī)科大學動物中心提供），體重220～250 g，隨機分為3組，每組14只。假手術組：大鼠稱重，戊巴比妥（50 mg/Kg）腹腔注射麻醉后，取上腹正中切口開腹，暴露第一肝門，不結(jié)扎，分兩層縫合腹壁。術后予以生理鹽水（5 mL/Kg）腹腔注射；對照組：手術步驟基本同1組，暴露肝臟左、中葉肝蒂。用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70%的肝臟缺血，關腹，生理鹽水（5 mL/kg）腹腔注射，90 min后去除血管夾，恢復肝血流180 min，建立肝臟I/R損傷的動物模型；HS治療組：動物模型同2組，予以HS（5 mL/kg）腹腔注射。

所有動物均在清潔級動物房飼養(yǎng)，再灌注180 min后處死。迅速下腔靜脈取血，并切取肝左葉。肝臟用冷生理鹽水沖洗后，一部分新鮮肝組織采用差速離心法獲取肝細胞線粒體，存于-80℃待測MDA、GSH及GSSH；一部分快速切取1 mm3樣品塊，浸入2.5%戊二醛溶液中待電鏡分析。

1.2 主要試劑

HS的制備方法［5-6］：將氫氣高壓（0.4 MPa）溶于生理鹽水6h以達到飽和濃度。飽和HS 4℃保存，并用伽馬射線滅菌。用氣相色譜法［7］檢測HS中氫濃度為0.86 mmol/L，達到了0.6 mmol/L的有效氫治療濃度［8］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒和氧化型谷胱甘肽（GSSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程所；線粒體抽提試劑盒購自美國Pierce公司；線粒體呼吸功能檢測試劑盒購自美國Genmed公司；ATP生物熒光試劑盒購自加拿大Sigma公司。

1.3 主要儀器

Synergy 2分光光度計（BioTek，美國）；WellscanMK 3酶標儀（Thermo，芬蘭）；H-7650分析型透射電鏡（Hitachi，日本）。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 線粒體形態(tài)學觀察 取2.5%戊二醛固定的標本，醋酸鈾染色，超薄切片干燥后，透射電鏡下觀察線粒體形態(tài)學變化。

1.4.2 線粒體MDA、GSH/GSSH檢測 取適量肝細胞線粒體，加入預冷的勻漿介質(zhì)（pH7.4，0.01 mol/L Tris-HCL，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01蔗糖，0.8%氯化鈉溶液）制成線粒體勻漿，按說明書步驟用分光光度計檢測樣本在532 nm和412 nm波長處的吸光度變化，并按標準曲線計算出線粒體MDA、GSH/GSSH的濃度。

1.4.3 線粒體功能檢測 本實驗采用線粒體呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、磷氧比（ADP/O）以及肝組織ATP含量作為線粒體功能指標。采用Clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能以及Sigma ATP生物熒光試劑盒測定肝組織內(nèi)ATP含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 線粒體形態(tài)學改變

透射電鏡可以看出缺血再灌注大鼠肝細胞線粒體形狀不規(guī)則、腫脹明顯，而且線粒體嵴紊亂、短小，基質(zhì)凝聚。HS處理組的大鼠肝細胞線粒體大小、形態(tài)較一致，線粒體嵴較規(guī)則，線粒體嵴膜及基質(zhì)結(jié)構(gòu)較清晰（圖1）。

圖1 透射電鏡觀察I/R后兩組大鼠肝細胞線粒體的變化情況（A、B×12 000；C、D×16 000）Figure1 Transmission electron microscopy analysis of the mitochondrial microstructure in rats of two groups after I/R

2.2 肝臟線粒體氧化應激水平變化

MDA是脂質(zhì)氧化的標記物，缺血再灌注后，大鼠肝細胞線粒體MDA水平顯著升高，而HS具有選擇性抗氧化性質(zhì)，能有效抑制肝細胞線粒體MDA生成（P＜0.01，圖2A）。GSH/GSSH能有效反應組織的抗氧化能力。與假手術組相比，對照組大鼠肝細胞線粒體GSH明顯降低，GSSH明顯增高，而5 ml/kgHS能將有效降低GSSH含量，提高線粒體內(nèi)GSH水平，顯著減輕肝細胞線粒體氧化損傷，并提高線粒體抗氧化能力（P＜0.01；圖2B、C）。

2.3 肝細胞線粒體功能變化

線粒體功能主要體現(xiàn)在ATP的合成和呼吸功能，缺血再灌注后大鼠肝細胞ATP合成明顯減少，線粒體呼吸控制率及磷氧比顯著降低，而HS能有效降低線粒體ATP消耗，提高線粒體呼吸控制率及磷氧比，從而增強線粒體呼吸功能（P＜0.01、圖3、表1）。

圖2 各組大鼠肝細胞線粒體氧化指標變化情況Figure2 Levels of mitochondrial MDA，GSH，and GSSH

表1 HS能顯著提高線粒體呼吸控制率及磷氧比，改善線粒體呼吸功能 （n=14）Table1 HS increased the RCR and ADP/D ratio and protected mitochondrial respiratory function（n=14）

圖3 各組大鼠肝細胞線粒體ATP消耗情況Figure3 Depletion of mitochondrial ATP in rat hepatocytes

3 討論

肝臟缺血再灌注是肝膽外科的常見病理過程，各種原因引起的休克、肝臟腫瘤手術時肝門阻斷和肝移植等均可引起缺血再灌注損傷。其可導致肝臟急性損傷，使患者術后并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率大大提高，從而延長患者住院周期，增加治療費用。因而有效地保護和改善缺血再灌注患者肝功能，在治療中具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷的機制可能與氧自由基（ROS）、炎性損傷、鈣超載、細胞凋亡等多種因素有關。缺血可以使氧自由基在體內(nèi)堆積，并使內(nèi)源性抗氧化劑不斷消耗，血液灌注恢復后缺血組織正反饋產(chǎn)生大量氧自由基，并激發(fā)中性粒細胞浸潤，損傷血管內(nèi)皮細胞，從而激發(fā)進一步的炎性級聯(lián)反應，從而加重組織損傷。缺血再灌注產(chǎn)生的ROS能夠直接作用于線粒體，造成線粒體損傷，并通過正反饋效應進一步促進ROS的產(chǎn)生［8-10］，進而引起線粒體和肝細胞的氧化損傷。線粒體主要通過氧化呼吸鏈產(chǎn)生ATP，為細胞的生化反應及生命活動提供能量，其功能主要體現(xiàn)在呼吸功能及ATP生成，因此線粒體功能也是決定肝細胞功能的重要因素［9，11］。線粒體氧化還原狀態(tài)的失衡能直接影響線粒體膜結(jié)構(gòu)，進而抑制線粒體呼吸功能的正常運行及ATP的產(chǎn)生。

MDA是氧化損傷的終產(chǎn)物，也是脂質(zhì)過氧化的標志，可以影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內(nèi)關鍵酶的活性。GSH是組成機體抗氧化系統(tǒng)的主要成分，既是清除過氧化氫的谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的底物，也是羥自由基和過氧陰離子的清除劑，在減輕氧自由基損傷、維持細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和抑制細胞凋亡等方面起著重要作用。GSH可以提供H+來中和氧自由基，其本身在GPx作用下被氧化成GSSH，后者通過NADPH，在谷胱甘肽還原酶作用下還原成GSH。在生理條件下GSH和GSSH形成動態(tài)平衡，維護著細胞氧化內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此檢測GSH和GSSG的變化可反映組織氧化還原狀態(tài)的改變。本研究中，我們直接檢測肝細胞線粒體氧化指標，結(jié)果表明缺血再灌注大鼠肝細胞線粒體氧化損傷明顯，抗氧化能力明顯降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后的大鼠肝細胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)了明顯損害，主要表現(xiàn)為RCR、磷氧比及肝組織ATP含量下降，線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯受損。

腹腔注射HS后，肝細胞線粒體較對照組MDA和GSSH的產(chǎn)生減少，GSH水平明顯提高，這表明HS能顯著減輕線粒體的氧化應激，提高線粒體抗氧化能力。HS還能顯著降低線粒體ATP消耗，抑制線粒體呼吸控制率及磷氧比的降低，從而改善線粒體功能。HS處理后電鏡顯示線粒體嵴更加規(guī)則，線粒體嵴膜及基質(zhì)結(jié)構(gòu)較對照組清晰，能有效維護線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

總之，本研究顯示腹腔注射HS能使氫分子直接到達肝細胞線粒體產(chǎn)生抗氧化效應，抑制肝細胞線粒體功能損傷及超微結(jié)構(gòu)改變，以達到減輕缺血再灌注肝功能損傷的作用，為氫分子的治療應用提供了亞細胞水平上的依據(jù)。具有廣泛的臨床應用前景。利用氫作為抗氧化物質(zhì)治療疾病現(xiàn)已經(jīng)成為醫(yī)學生物界新的研究熱點。理論上看，氫與自由基反應的產(chǎn)物是水，多余的氫可自動釋放到體外，對人體無毒性作用。目前，對于HS的研究多集中于動物實驗，國內(nèi)外已有飲用氫水進行臨床試驗的報道［12-15］，國內(nèi)已有醫(yī)院正在申請HS進入臨床試驗階段。由于氫氣的制備方法非常成熟，價格便宜，如果HS將來成功應用于臨床，可有效提高疾病治療效果，顯著降低治療費用。

1 Peglow S,Toledo AH,Anaya-Prado R,et al.Allopurinol and xanthine oxidase inhibition in liver ischemia reperfusion[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2011,18(2):137-146.

2 Wang CC,Zhang PJ.Targeting mitophagy for the treatment of liver diseases[J].Chin Arch Gen Surg(Electronic Edition),2013,7(5):397-399.[王超臣,張培建.線粒體自噬在肝相關疾病中的作用[J].中華普通外科學文獻(電子版),2013,7(5):397-399.]

3 Sun CK,Zhang XY,Sheard PW,et al.Change in mitochondrial membrane potential is the key mechanism in early warm hepatic ischemia-reperfusion injury[J].Microvasc Res,2005,70(1-2):102-110.

4 Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K,et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med,2007,13(6):688-694.

5 Liu Q,Shen WF,Sun HY,et al.Hydrogen-rich saline protects against liver injury in rats with obstructive jaundice[J].Liver International,2010,30(7):958-968.

6 Chen H,Sun YP,Hu PF,et al.The Effects of Hydrogen-Rich Saline on the Contractile and Structural Changes of Intestine Induced by Ischemia-Reperfusion in Rats[J].Journal of Surgical Research,2011,167(2):316-322.

7 Buchholz BM,Kaczorowski DJ,Sugimoto R,et al.Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intestinal graft injury[J].Am J Transplant,2008,8(10):2015-2024.

8 Bhogal RH,Curbishley SM,Weston CJ,et al.Reactive oxygen species mediate human hepatocyte injury during hypoxia/reoxygenation[J].Liver Transpl,2010,16(11):1303-1313.

9 Jaeschke H,Woolbright BL.Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J].Transplant Rev(Orlando),2012,26(2):103-114.

10 Tan JF,Wang XL,Jin ZH.The latest knowledge of mechanism and prevention of hepatic ischemia reperfusion injury[J].Chinese Journal of Difficult and Complicated Cases,2013,12(12):979-981.[譚金鋒,王現(xiàn)雷,金哲浩.肝缺血再灌注損傷機制與防治的最新認識[J].疑難病雜志,2013,12(12):979-981.]

11 Sun K,Xie X,Liu Y,et al.Autophagy lessens ischemic liver injury by reducing oxidative damage[J].Cell&Bioscience,2013,3(1):26.

12 Kang KM,Kang YN,Choi IB,et al.Effects of drinking hydrogen-rich water on the quality of life of patients treated with radiotherapy for liver tumors[J].Med Gas Res,2011,1(1):11.

13 Xia C,Liu W,Zeng D,et al.Effect of hydrogen rich water on oxidative stress,liver function and viral load in patients with chronic hepatitis B[J].Clin Transl Sci,2013,6(5):372-375.

14 Nakao A,Toyoda Y,Sharma P,et al.Effectiveness of hydrogen rich water on antioxidant status of subjects with potential metabolic syndrome-an openlabel pilot study[J]J Clin Biochem Nutr,2010,46(2):140-149.

15 Matsumoto S,Ueda T,Kakizaki H.Effect of supplementation with hydrogen-rich water in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome[J].Urology,2013,81(2):226-230.