RNAi抑制PIAS3表達對膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響

紀 華 余 巍 陳 宏 李光輝 王東林

信號轉導調控的失常往往會導致腫瘤的發(fā)生，其中信號轉導和轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）轉導通路與腫瘤發(fā)生密切相關，家族成員的異常活化見于許多惡性腫瘤。PIAS3（protein inhibitor of activated STAT3）蛋白是活化STAT3的抑制分子，通過阻斷STAT3與DNA結合發(fā)揮抑制作用的［1］，在STAT3信號途徑中發(fā)揮著負向調控的作用。為了進一步了解PIAS3蛋白的功能，本研究用RNAi技術特異性抑制PIAS3的表達，觀察膠質瘤細胞凋亡和細胞周期變化。

1 材料與方法

1.1 材料

引物由北京奧科生物技術公司合成；干擾質粒pSilencer 2.0-U6、宿主菌株DH5α由本實驗室保存；人膠質瘤細胞株U251細胞、CHG-5細胞由西南醫(yī)院病理研究所提供；DOTAP脂質體轉染試劑為德國Roche公司產品；兔抗 PIAS3（sc-14017）購自 Santa Cruz公司；抗人β-actin抗體購自博士德公司；HRP標記的IgG抗體為北京鼎國公司進口分裝產品；Annexin V-FITC檢測試劑盒為南京凱基公司產品。

1.2 方法

1.2.1 RNA干擾質粒構建 針對PIAS3目的基因mRNA序列，選擇三個針對PIAS3（NCBI：NM_006099）的RNAi靶位點，分別為：靶位點Ⅰ：5'-gaaggtcgaagttattgac-3'；靶位點Ⅱ：5'-gtgcagcagattcttacat-3'；靶位點Ⅲ：5'-tctcttatcat tgatggt-3'，含有PIAS3基因RNAi的3個特異性序列的寡核苷酸單鏈（英駿公司合成）退火形成雙鏈后，插入pSilencer 2.0-U6質粒，將三個干擾質粒轉染CHG-5細胞，用半定量RT-PCR方法檢測PIAS3基因的表達情況，從3個干擾質粒中選擇一個干擾效率最高的重組質粒進行RNAi實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉染 U251、CHG-5細胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。按DOTAP脂質體轉染試劑說明書操作，將干擾質粒轉染對數生長期的細胞，無血清培養(yǎng)10 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 RT-PCR檢測目的基因表達 用Roche公司的Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄后做RT-PCR擴增，參照GeneBank中PIAS3基因的開放閱讀框序列設計引物，序列如下：F：5'-TCAAGGTCAATGGGAAACTG-3'，R：5'-GTGGGAGACTGGACAGGAAA-3'，產物900 bp。PCR反應條件：94℃ 15 s，56℃ 30 s，68℃ 1 min，30個循環(huán)，最后68℃延伸10 min。內參選用GAPDH基因序列設計引物，序列如下：F：5'-CGGGAAACTGTGGCGT GAT-3'，R：5'-CAAAGGT GGAGGAGTGGGT-3'，產物311 bp。PCR反應條件：94℃ 15 s，56℃ 30 s，68℃ 30 s，30個循環(huán)，最后68℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 免疫印跡（Western blot） 基因轉染48 h后提取轉染細胞總蛋白，Bradford法測蛋白濃度。樣品于100℃水浴5 min，取等量蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗（1:1 000稀釋）4℃孵育過夜，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG抗體（1:2 000稀釋），室溫孵育2 h，DAB顯色。

1.2.5 流式細胞儀檢測轉染細胞凋亡 以0.25%胰酶消化轉染細胞，0.01 M PBS漂洗2次，參照Annexin V-FITC檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測（Ex=488 nm；Em=530 nm）細胞凋亡的情況（綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測）。

1.2.6 流式細胞技術檢測轉染細胞增殖周期 以0.25%胰酶消化轉染細胞，0.01 M PBS漂洗2次，加入核糖核酸酶及碘化丙啶染液，避光染色30 min，流式細胞儀檢測（Ex=488 nm）細胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計學方法

以SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包采取單因素方差分析、獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 干擾質粒的構建

質粒用Bam HI和HindⅢ雙酶切后，與上述含有同樣酶切位點的雙鏈寡核苷酸在連接酶作用下進行等摩爾連接環(huán)化，分離環(huán)化產物并轉染到DH5α感受態(tài)細菌，抗性篩選陽性克隆進行酶切鑒定，對酶切鑒定正確的克隆進行測序，將測序結果和設計序列比較后證明融合區(qū)域的堿基序列正確，并有正確的方向，表明干擾質粒克隆正確。對插入序列正確的質粒行大量擴增，并用質粒提取試劑盒提取質粒，得到PIAS3基因特異性的干擾表達質粒，分別稱為干擾質粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

2.2 干擾質粒篩選

將這3個質粒轉染CHG-5細胞，從轉染質粒的膠質瘤細胞中提取總RNA，經RT-PCR擴增出900bP的片段，由圖1可以看出，與未轉染細胞相比，干擾質粒Ⅰ的干擾效率較干擾質粒Ⅱ和Ⅲ高。通過對積分密度值（Integrated Density Value，IDV）進行半定量分析，結果顯示，正常CHG-5細胞能表達高水平的PIAS3 mRNA，3組干擾質粒的IDV與對照組相比，明顯降低（P＜0.01），提示3個干擾質粒均能顯著且特異地抑制PIAS3 mRNA的表達，且P干擾質粒Ⅰ＜P干擾質粒Ⅲ＜P干擾質粒Ⅱ，提示干擾質粒Ⅰ特異性抑制PIAS3 mRNA表達的能力最強，所以下面的RNAi實驗均選用干擾質粒Ⅰ。

圖1 3個干擾質粒對CHG-5細胞PIAS3mRNA的特異性抑制Figure1 mRNA expression of PIAS3 was suppressed after the three RNAi expression vector targeting PIAS3 were transfected into CHG-5 cells

2.3 RNAi質粒轉染對U251細胞PIAS3的影響

RNAi質粒轉染U251細胞48 h后收獲細胞，以轉染pSilencer 2.0的U251細胞為對照進行RT-PCR。通過RT-PCR實驗發(fā)現，對照組和轉染組的U251細胞在900bP處皆可見的特異性PIAS3基因條帶，但轉染組條帶明顯比對照組暗淡，半定量檢測發(fā)現轉染細胞的PIAS3 mRNA表達下降了85.7%，提示RNAi能夠有效抑制U251細胞PIAS3 mRNA的表達（圖2）。

轉染細胞中PIAS3蛋白表達：Western blot檢測結果顯示，轉染質粒的U251細胞與對照組細胞相比，轉染細胞的PIAS3蛋白表達下降了60%（圖3）。

2.4 RNAi對U251細胞凋亡的影響

U251細胞經PIAS3基因短暫轉染48h后，行流式細胞儀分析，如表1所示，干擾質粒轉染U251細胞后，早期細胞凋亡率明顯低于未轉染組和空載體對照組（P＜0.01），而活細胞率與未轉染組和對照組比較，差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示抑制U251的PIAS3表達能夠減弱U251細胞的凋亡。

2.5 RNAi對U251細胞周期的影響

流式細胞儀測定細胞周期的結果顯示（圖4）。行流式細胞儀分析，轉染組U251細胞的檢測結果顯示（表2），G1、G2和S期細胞比例分別為：（56.8±6.3）%、（22.6±3.8）%、（19.1±2.7）%，而未轉染組的U251細胞G1、G2和S期細胞比例分別為（58.2±7.6）%、（17.3±2.96）%、（24.5±4.1）%。與未轉染組的U251細胞比較，轉染組的U251細胞G2期細胞比例升高，S期細胞比例降低，具有顯著性差異（P＜0.05），G1期細胞比例無明顯變化（P＞0.05）。

圖2 膠質瘤細胞PIAS3 mRNA被RNAi質粒特異性抑制Figure2 mRNA expression of PIAS3 before and after RNAi expression vectors were transfected into U251 cells

圖3 RNAi對U251細胞表達PIAS3的影響Figure3 Effect of RNAi on PIAS3 expression in U251 cells

表1 3組U251膠質瘤細胞的細胞凋亡分析 （n=3，±s）Table1 Analysis of apoptosis in the three groups（n=3，±s）

表1 3組U251膠質瘤細胞的細胞凋亡分析 （n=3，±s）Table1 Analysis of apoptosis in the three groups（n=3，±s）

B1：damaged cells；B2：late apoptosis cells；B3：normal cells；B4：early apoptosis cells；*：P＜0.01

Group Control Transfected by pSilencer 2.0 Transfected by RNAi expression vectors Rate（%）B1 0 0 0 B2 0.3±0.1 0.4±0.1 0.4±0.1 B3 94.7±1.2 96.3±0.9 98.1±0.5 B4 3.7±1.0 2.8±0.7 0.7±0.3*

圖4 RNAi對U251細胞系細胞周期的影響Figure4 The cell cycle of U251 cells before and after transfection by RNAi expression vectors

表2 U251細胞周期分析 （n=3，±s）Table2 Analysis of the cell cycle after the selected vector was transfected into U251 cells（n=3，±s）

表2 U251細胞周期分析 （n=3，±s）Table2 Analysis of the cell cycle after the selected vector was transfected into U251 cells（n=3，±s）

*：P＜0.05

Group Non-transfection group Transfection group G1（%）58.2±7.6 56.8±6.3 G2（%）17.3±2.96 22.6±3.8*S（%）24.5±4.1 19.1±2.7*

3 討論

PIAS家族有PIAS1、PIAS3、xα、xβ和y 5個成員，現已證明PIAS蛋白不僅可與STAT分子發(fā)生作用，還與70多種蛋白質發(fā)生相互作用，并影響它們的活性和功能。PIAS蛋白家族參與調控多個細胞信號通路，在細胞的增殖、分化和凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中，均發(fā)揮著重要的作用［2］。Wang等［3］發(fā)現PIAS3在許多惡性腫瘤中都有表達，且與正常組織比較，表達量增加，其中包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和腦腫瘤。

RNAi技術在對細胞基因功能研究中有著廣泛的應用。本研究采用脂質體基因轉染，選用膠質瘤細胞系CHG-5作為篩選干擾質粒的細胞株，它來源于Ⅱ級星形膠質細胞瘤［4］，將3個干擾質粒轉染CHG-5細胞，選取干擾效率最高的質粒作為后期實驗用干擾質粒。將質粒pSilencer 2.0-U6空白質粒和選取的干擾質粒轉染U251細胞，經RT-PCR和Western blot檢測其表達產物，未轉染組相比較，PIAS3表達減弱。U251細胞短暫轉染48 h后，光鏡觀察和流式細胞儀檢測都發(fā)現，抑制PIAS3基因后，膠質瘤U251細胞生長加快，細胞凋亡減少。

近年的研究發(fā)現PIAS家族蛋白有小分子泛素樣調節(jié)因子（small ubiquitin like modifier，SUMO）-E3連接酶活性［5］，作為 SUMO 化的連接酶發(fā)揮作用［6］。DNA損傷應答過程有2個E3-SUMO酶參與，PIAS1和PIAS4在DNA斷裂時分別促進SUMO2/3和SUMO1與底物的連接［7-8］。PIAS蛋白的耗竭會影響損傷細胞DNA損傷的修復，提示依賴于PIAS的泛素化對于DNA雙鏈斷裂的修復是必要的。PIAS蛋白的另一個功能是類似一個結構平臺，募集其他蛋白質分子形成復合物，進而發(fā)揮轉錄調控和信號傳導的作用。對于STAT1、STAT3以及NF-κB（核因子κB）等轉錄因子，PIAS1和PIAS3行使抑制功能就是通過這種非SUMO化依賴的方式阻斷轉錄因子與DNA的結合來實現的［9-10］。此外，PIAS蛋白分子能夠使轉錄因子在細胞核內移位，重新定位于不同的亞核區(qū)域，與靶基因接近，實現了轉錄因子與DNA的特異性結合［11］。正是通過這些機制，PIAS蛋白能夠影響許多蛋白的功能，這些蛋白的主要作用是調控基因轉錄，因此，可以認為PIAS蛋白是轉錄的共調節(jié)子（coregulators）。研究顯示，許多種癌細胞中的STAT3受到抑制時，STAT3的靶基因表達相應下調，這其中就包括了Bcl-xl，c-myc、cyclin D1［12］、Bcl2、Mcl-1［13］和 survivin［14］基因，這些基因與細胞增殖和凋亡密切相關，它們的下調誘導了癌細胞的凋亡。Konnikova等［15］也研究證明，用RNAi方法減弱STAT3表達后，能夠誘導膠質瘤細胞凋亡，腫瘤細胞不僅出現形態(tài)學改變，而且細胞活力下降。本研究證實減弱對pSTAT3的抑制出現腫瘤細胞拮抗凋亡。

S期腫瘤細胞對化療藥物敏感，尤其是周期特異性化療藥物，本研究顯示，抑制PIAS3的U251細胞S期比例下降，導致腫瘤細胞對藥物的敏感性下降。據此推測，抑制PIAS3表達可能通過激活（PI3-K）/（PKB）信號途徑使S期細胞比例降低，表現為具有化療藥物抵抗。

抑制PIAS3表達誘導膠質瘤U251細胞拮抗凋亡，并出現細胞周期改變，其具體機制還有待于進一步研究，以上結果可以為神經膠質細胞瘤的發(fā)病機理提供部分實驗依據。

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