轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件對(duì)外源性鈣離子ATP酶SERCA1a表達(dá)的影響

王國麗 大寶貴嗣 山崎和生 Stefania Danko 鈴木裕＊

（1中國醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110001；2旭川醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)講座，日本 旭川078－8501）

SERCA1a是肌漿網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶 （sarco－endoplasmic calcium transporting ATPase，SERCA）的成人骨骼肌型，通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子入肌漿網(wǎng)，維持細(xì)胞正常的鈣離子濃度及梯度，保證肌肉收縮舒張的正常進(jìn)行［1］。在應(yīng)用突變法研究SERCA1a結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系時(shí)，有些變異型SERCA1a在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，無法提取足夠的微粒體蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為尋找SERCA1a表達(dá)的最適條件，解決這類蛋白質(zhì)獲取不足問題，本文通過比較COS1表達(dá)的外源性SERCA1a表達(dá)量及酶活性的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑用量以及攜帶兔SERCA1a cDNA的p MT2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染用量等可能影響SERCA1a表達(dá)的因素進(jìn)行了評(píng)估。

材料和方法

1.一般材料

非洲綠猴腎細(xì)胞COS1細(xì)胞購自ATCC。DMEM、FBS、Lipofactamine、plus reagent購自Invitrogen。p MT2載體和p MT2－SERCA1a質(zhì)粒獲贈(zèng)于加拿大多倫多大學(xué)D.H.Mac Lennan教授。其余試劑分別購自日本和光株式會(huì)社和Sigma公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

COS1細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，無抗生素。培養(yǎng)箱設(shè)置100%濕度、5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)溫度為37℃。

細(xì)胞融合度70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中使用無血清DMEM。常規(guī)每皿加入p MT2空質(zhì)?；騪 MT2－SERCA1a質(zhì)粒 DNA 8μg、lipofactamine 60μl、plus reagent 40μl混合物孵育5 h。更換含血清的DMEM后，于37℃或者降低至34℃、31℃繼續(xù)培養(yǎng)2至5 d。每皿DNA 4μg或lipofactamine 30μl、plus reagent 20μl的常規(guī)半量轉(zhuǎn)染亦分別進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)與常規(guī)全量轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)相同。

3.微粒體制備

將10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長的COS1細(xì)胞用5 ml PBS洗2次后收集至2 ml含5 mmol／l EDTA的PBS液，再用5 ml PBS洗1次。加2 ml低滲液（10 mmol／l Tris－HCl、p H 7.5、0.5 mmol／l MgCl2），10 min后加入蛋白酶抑制劑aprotinin 200μ和100 mmol／l PMSF 20μl，使用Dounce玻璃勻漿器勻漿40下。加入2 ml溶液A（蔗糖0.5 mol／l、β巰基乙醇6 mmol／l、CaCl240μmol／l、KCI 300 mmol／l、Tris－HCl 10 mmol／l，p H 7.5），繼續(xù)勻漿20下，10000 g離心20 min。將上清與2.5 mol／l KCl 0.9 ml混勻，150000 g離心10 min（Himac CS 100FX，Hitachi）。微粒體沉淀用100μl溶液B混懸，零下80℃保存。溶液B成分為蔗糖0.25 mol／l、β巰基乙醇3 mmol／l、CaCl220μ mol／l、KCI 150 mmol／l、Tris－HCl 10 mmol／l，p H 7.5。離心在4℃進(jìn)行，其它步驟均在低溫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)冰上完成。

4.蛋白質(zhì)定量

微粒體蛋白濃度的檢測(cè)應(yīng)用Lowry法，每樣本或標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)4平行孔，變異系數(shù)低于2%。

微粒體中的SERCA1a蛋白由雙抗體夾心ELISA法定量。固相抗體為羊抗兔SERCA1a IgG，一抗為鼠SERCA1a單克隆抗體（MA3－911，Affinity Bioreagents），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG，底物為TMB（Life Technologies）。加入0.2 N硫酸終止顯色反應(yīng)，450 nm測(cè)吸光度。每個(gè)樣本或每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)5個(gè)平行孔。

5.SERCA1a蛋白特異的的Ca2＋－ATP酶活性檢測(cè)

應(yīng)用同位素法對(duì)SERCA1a水解ATP的酶活性進(jìn)行檢測(cè)。ATP水解的速率在25℃測(cè)定。反應(yīng)體系為50μl，含10μg／ml微粒體蛋白、50 mmol／l MOPS／Tris（p H 7.0）、0.1 mol／l KCl、7 mmol／l MgCl2、0.55 mmol／l CaCl2、0.5mmol／l EGTA、1μmol／l A23187、0.1 mmol／l［γ－32P］ATP。反應(yīng)時(shí)間為5、10、15、20 min。萃取游離磷酸，進(jìn)行β閃爍計(jì)數(shù)。其時(shí)間放射性曲線為直線，斜率即單位時(shí)間內(nèi)被0.5μg微粒體蛋白水解的ATP量。上述ATP酶活性需減去非鈣離子依賴的ATP酶活性，方為Ca2＋依賴的ATP酶活性。非鈣離子依賴的ATP酶活性檢測(cè)體系含5 mmol／l EGTA，但不加CaCl2，其余同上。計(jì)算過表達(dá)的外源SERCA1a蛋白特異的Ca2＋－ATP酶活性，還需要減去由p MT2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的對(duì)照微粒體蛋白的Ca2＋－ATP酶活性本底，該本底為COS1細(xì)胞內(nèi)源蛋白的Ca2＋－ATP酶活性，低于外源性SERCA1a蛋白Ca2＋－ATP酶活性的3%。

6.SERCA1a蛋白的EP生成量測(cè)定

EP生成量在0℃測(cè)定。反應(yīng)體積為50μl，含50 μg／ml微粒體蛋白、50 mmol／l MOPS／Tris （p H 7.0）、0.1 mol／l KCl、7 mmol／l MgCl2、0.55 mmol／l CaCl2、0.5mmol／l EGTA、1 μmol／l A23187、0.01 mmol／l［γ－32P］ATP。反應(yīng)10 s，加入15%TCA 及0.3 mol／l Pi。離心，5%SDS－PAGE分離沉淀蛋白質(zhì)后，與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行放射自顯影定量?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微粒體蛋白EP生成量做為本底被減去，其EP生成量低于含外源SERCA1a的微粒體蛋白的EP生成量的5%。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.SERCA1a蛋白表達(dá)量檢測(cè)

p MT2－SERCA1a質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的微粒體蛋白含外源DNA過度表達(dá)的野生型SERCA1a（wild type，wt），而p MT2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的微粒體蛋白僅含內(nèi)源性鈣離子ATP酶SER－CA，故作為分析和計(jì)算的對(duì)照或本底（control，ct）。37℃培養(yǎng)的細(xì)胞微粒體蛋白的產(chǎn)量約為0.1 mg／皿，而其中SERCA1a的含量大致為1－2%。

質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染用量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微粒體蛋白表達(dá)量及SERCA1a表達(dá)量的影響分別參見表1和圖1。37℃培養(yǎng)的結(jié)果與34℃培養(yǎng)接近，不同條件的常規(guī)全量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的微粒體蛋白及SERCA1a定量結(jié)果與半量試劑轉(zhuǎn)染結(jié)果無明顯差異，故本文圖表未列出37℃培養(yǎng)及常規(guī)全量試劑轉(zhuǎn)染的具體數(shù)據(jù)。

Lowry定量結(jié)果（表1）表明，微粒體蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)3至4 d達(dá)到高峰，培養(yǎng)溫度變化對(duì)其無顯著影響。培養(yǎng)1 d微粒體蛋白量隨著培養(yǎng)溫度升高而增長，符合細(xì)胞生長增殖與溫度的正相關(guān)關(guān)系。培養(yǎng)5 d，4μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞微粒體蛋白量明顯高于8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.01）。

表1 Lowry法微粒體蛋白定量結(jié)果Table 1 Detection of microsomal proteins by Lowry method

ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度及提高DNA轉(zhuǎn)染用量，可一定程度提高SERCA1a表達(dá)量。SERCA1a表達(dá)量在8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞31℃培養(yǎng)3 d最高，顯著高于其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件下的SERCA1a表達(dá)量（P＜0.01）。其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件均在4 d達(dá)到高峰。

圖1 微粒體蛋白中SERCA1a濃度的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of SERCA1a in microsomal proteins by ELISA

2.SERCA1a酶活性評(píng)估

34℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性顯著高于31℃表達(dá)的SERCA1a（P＜0.01，圖2），但仍明顯低于37℃表達(dá)的SERCA1a水解ATP的速度3.36±0.03 mol／min／mg（P＜0.05）［2］。31℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長而增加（P＜0.01），此變化趨勢(shì)在34℃不典型。37℃SERCA1a的ATP酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)2至5 d期間無明顯變化，亦不受其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件影響。

圖2 SERCA特異性的鈣離子ATP酶活性Fig.2 Specific Ca2＋ATPase of SERCA

EP定量結(jié)果與ATP酶活性的結(jié)果的變化趨勢(shì)基本一致（圖3）。37℃表達(dá)的SERCA1a生成EP總量為3.31±0.41 nmol／mg2，顯著高于31℃表達(dá)的SERCA1a（P＜0.01），但是僅略高于34℃表達(dá)的SERCA1a，甚至略低于34℃培養(yǎng)5 d的細(xì)胞表達(dá)的SERCA1a。

圖3 SERCA1a的磷酸化酶中間體EP的生成水平Fig.3 Phosphorylation level of SERCA1a

討 論

檢測(cè)結(jié)果表明：微粒體蛋白量在細(xì)胞培養(yǎng)3至4 d達(dá)到高峰，改變轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)條件，未見明顯變化；降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度及提高DNA轉(zhuǎn)染用量，可增加SERCA1a表達(dá)量，SERCA1a表達(dá)量在8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞31℃培養(yǎng)3 d達(dá)到最高；降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度后，SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量也隨之下降，并且ATP酶活性比EP生成量的下降幅度更大。在最低的細(xì)胞培養(yǎng)溫度31℃，SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，而此趨勢(shì)在34℃和37℃表達(dá)的SERCA1a卻不明顯。

通過一系列實(shí)驗(yàn)，可以確定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞表達(dá)外源SERCA1a蛋白的最適條件為常規(guī)的半量轉(zhuǎn)染試劑、全量DNA、37℃培養(yǎng)3至4 d。不過全量DNA轉(zhuǎn)染與半量DNA轉(zhuǎn)染相比，SERCA1a表達(dá)量雖然最高可增至1.5倍，在質(zhì)粒DNA量不十分充足時(shí)，增加培養(yǎng)皿的數(shù)目比單皿DNA用量加倍可收獲更多SERCA1a蛋白。而應(yīng)用常規(guī)半量轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢(shì)則十分突出，比使用全量轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)濟(jì)，又在不減少SERCA1a產(chǎn)量的前提下，降低轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性。

我們的結(jié)果與Muerhoff AS.的報(bào)道接近，提示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3至4 d，細(xì)胞生長增殖達(dá)及外源蛋白的表達(dá)均達(dá)到高平臺(tái)期［3］。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了值得特別注意的現(xiàn)象，那就是降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度可以提高外源蛋白的產(chǎn)量，但是這些過度表達(dá)的SERCA1a的EP生成量降低，ATP酶活性的降低更加顯著。在SERCA1a水解ATP轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的5步反應(yīng)循環(huán)中［2］，SERCA1a先被ATP磷酸化形成磷酸化的酶中間體EP，然后EP被水解釋放有機(jī)磷酸，才能全部完成ATP水解成ADP和磷酸的反應(yīng)（圖4）。因此，低溫表達(dá)的SERCA1a表達(dá)量增加，EP生成量降低，ATP酶活性的降低更多，可以用低溫條件下蛋白錯(cuò)誤折疊增加而蛋白降解相關(guān)蛋白的活性下降解釋［4－6］。在31℃，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的SERCA1a增加，而細(xì)胞降解錯(cuò)誤折疊和衰老蛋白質(zhì)的能力下降，所以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的SERCA1a有一部分結(jié)構(gòu)異常，這部分蛋白質(zhì)可能無法形成EP，即使形成EP，這些EP可能無法水解生成無機(jī)磷酸或者水解速度減低。31℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量隨培養(yǎng)時(shí)間延長而的變化趨勢(shì)從另一個(gè)角度支持上述觀點(diǎn)。在31℃，蛋白正確折疊與蛋白降解相關(guān)蛋白的活性下降，然而隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，正確折疊蛋白質(zhì)的比例及應(yīng)降解蛋白質(zhì)的降解總量不斷增長，達(dá)到高平臺(tái)期的時(shí)間晚于37℃和34℃，所以呈現(xiàn)5 d內(nèi)SERCA1a的ATP酶活性及4 d內(nèi)EP生成量隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加的趨勢(shì)。

圖4 SERCA1a反應(yīng)循環(huán)模式圖Fig.4 The reaction cycle of SERCA1a

綜上所述，增加外源SERCA1a蛋白在COS1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可通過提高DNA轉(zhuǎn)染用量實(shí)現(xiàn)。降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度雖可增加SERCA1a表達(dá)量，但引起SERCA1a蛋白的ATP酶活性和EP生成量下降。為獲取足夠的目的蛋白進(jìn)行研究，對(duì)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件進(jìn)行最適化是必要的。需要特別注意的是某些條件下部分過度表達(dá)的外源蛋白可能不具備正常的結(jié)構(gòu)與功能。用蛋白定量替代蛋白的生物功能及生物效應(yīng)監(jiān)測(cè)的場合，需要謹(jǐn)慎地進(jìn)行結(jié)論推斷。

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