杜仲MVA途徑相關基因全長cDNA序列特征研究

王 淋，烏云塔娜，劉慧敏，葉生晶，杜紅巖

(1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研發(fā)中心，河南 鄭州 450003)

杜仲MVA途徑相關基因全長cDNA序列特征研究

王 淋1a,b，烏云塔娜2，劉慧敏1a,b，葉生晶1a,b，杜紅巖2

(1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研發(fā)中心，河南 鄭州 450003)

杜仲幼果和成熟果轉錄組測序的基礎上，分離鑒定了幼果和成熟果MVA途徑ACOT、HMGS、HMGR基因全長cDNA序列，并對基因的核苷酸序列及其相應氨基酸序列的組成成分、跨膜結構域、疏水性/親水性、蛋白質二、三級結構、分子系統(tǒng)進化等進行分析。EuACOT基因全長cDNA為1 248 bp，編碼416個氨基酸，屬于穩(wěn)定疏水性蛋白，無明顯的跨膜區(qū)，在進化上分屬于不同的分類群，與煙草和番茄的ACOT蛋白間的親緣關系最為接近；EuHMGS基因全長cDNA為1 356 bp，編碼452個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的疏水性蛋白，無明顯的跨膜區(qū)，在進化上分屬于不同的分類群，與茶樹的HMGS蛋白間的親緣關系最為接近；EuHMGR基因全長cDNA為1 770 bp，編碼590個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的疏水性蛋白，有兩個較明顯的跨膜區(qū)，在進化上分屬于不同的分類群，與杜仲的HMGR蛋白間的親緣關系最為接近；以上三個蛋白的二級結構均是以α-螺旋和螺環(huán)結構為主的混合型結構。

杜仲；萜類物質； MVA途徑；序列分析；生物信息學

杜仲Eucommia ulmoidesOliv. 為落葉喬木，單科單屬，又名絲楝樹皮、膠樹等，是我國特有新生代第三紀孑遺植物[1]。杜仲的藥用價值較高，是名貴的中藥材；除此之外，杜仲的葉子、果實，樹皮等組織均含有大量的白色絲狀物質-杜仲膠，杜仲膠是天然橡膠之一，其化學成分為都是反-1，4-聚異戊二烯，而是巴西橡膠分順-1，4-聚異戊二烯，兩者互為同分異構體，但是物理性質卻有大不相同，杜仲膠具有塑膠二重性，是目前最有開發(fā)前景的溫帶膠資源，具有較高的工業(yè)應用價值[2-3]。

乙酰CoA酰基轉移酶 (AOCT) 是萜類化合物生物合成甲羥戊酸 (MVA)途徑的起始酶， 催化使2個分子的乙酰CoA 縮合為乙酰乙酰CoA，AOCT催化蛋白質的酰基化和去酰基化，在真核生物中蛋白質翻譯后修飾中?；腿ヵ；瞧毡榈姆绞?，AOCT屬于硫解酶，能催化蛋白質的酰基化和去?；訟OCT具有調節(jié)蛋白質活性、基因表達等功能[4-5]。羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因(HMGS)是甲羥戊酸途徑中的重要的代謝酶，在MVA途徑中，在HMGS催化下，乙酰CoA和乙酰乙酰CoA能生成羥甲基戊二酰CoA[6]，進一步產生IPP，IPP為萜類物質合成提供前體，因此，HMGS在萜類物質的合成中扮演著重要的角色。不同基因編碼有不同的基因亞細胞定位以及基因的表達也不同，HMGS基因家族成員有細胞質和線粒體兩種形式。HMGS在細胞質中催化還原底物，為各種類異戊二烯化合物提供前體化合物IPP的合成，而位于線粒體中HMGS形式目前很少在植物中發(fā)現(xiàn)，與細胞質中的HMGS功能不同，位于線粒體的HMGS主要為酮體產生前體[7-8]。羥甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR) 是天然橡膠類異戊二烯合成途徑中關鍵酶之一，作為MVA途徑首個限速酶， HMGR催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A從而形成甲羥戊酸，對甲羥戊酸代謝“碳流”的調控起決定性作用[9]。根據(jù)所含異戊二烯數(shù)目不同，萜類物質可以分單萜、陪半萜、雙萜、三萜和多萜等等，例如在馬鈴薯中，HMGR1基因與合成甾類化合物密切相關，而倍半萜植保素合成卻與HMGR1 同一家族的HMGR2和HMGR3基因有關[10-11]。HMGR不僅與天然橡膠合成有關，同時也是類胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素等合成的相關酶之一[12]。

對杜仲幼果和成熟果實MVA途徑ACOT、HMGS、HMGR基因進行詳細的生物信息學分析，可為進一步深入研究杜仲萜類物質合成相關酶奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

對杜仲膠合成時期轉錄組測序及轉錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[13-14]，其中萜類物質合成MVA途徑共涉及30條Unigene，其中鑒定了ACOT、HMGS、HMGR基因分別有7條、3條、11條。

1.2 方 法

根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information, http: //www. ncbi. nlm.nih.gov/)中 核酸及蛋白質數(shù)據(jù)庫ACOT、HMGS、HMGR基因的核酸序列及其對應的氨基酸序列進行相似性檢索，并利用ORF Finder程序查找出基因cDNA 開放閱讀框；利用ExPASyProtParam( http: / /cn．expasy．org) 程序與ScanProsite程序對氨基酸殘基數(shù)、氨基酸組成、蛋白質相對分子量、理論等電點以及蛋白質的親疏水性等性質進行了分析；利用TMHMM程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白質跨莫結構域；利用PSIPRED 程 序 ( http: / /bioinf．cs．ucl．ac．uk /psipred) 預測蛋白質的二級結構；利用ESyPred3D Web Server程序，根據(jù)基因氨基酸序列進行蛋白同源建模，準確預測蛋白質的三級結構；利用MEGA 5 軟件構建基因系統(tǒng)進化樹，對蛋白的親緣關系進行相關的分析。

2 結果與分析

2.1 EuACOT基因的生物信息學分析

2.1.1 EuACOT基因的理化性質預測與分析

EuACO（Unigene1729）氨基酸序列與煙草 Nicotiana tabacum（AAU95619.1）、 番 茄 紅素 Solanum lycopersicum（XP_004236650.1）、 桃Prunus persica（EMJ12994.1）的ACOT氨基酸序列的相似性均為81%（見圖1）。EuACOT1基因全長cDNA長度為1 248 bp，編碼416個氨基酸，其中甘氨酸（11.5%）＞丙氨酸（11.5%）＞亮氨酸（10.1%）三種氨基酸含量最高，EuACOT蛋白相對分子量為43.18 kD，理論等電點為9.01；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為31.84，屬于穩(wěn)定蛋白質。

2.1.2 EuACOT基因疏水性/親水性的預測

Expasy Protscale程序分析EuACOT蛋白親水性/疏水性的結果如圖2所示，EuACOT蛋白氨基酸殘基中以A375疏水性最強(3.000)，以A183親水性最強(-2.211)，疏水氨基酸的數(shù)量的數(shù)量大于親水氨基酸，故推斷 EuACOT為疏水性蛋白。

2.1.3 EuACOT編碼蛋白的疏水/親水性預測與分析

EuACOT蛋白的疏水/親水性預測的結果如圖2所示，EuACOT蛋白氨基酸殘基中A375(3.000)疏水性最強，以A183(-2.211)親水性最強，A375(3.000)＞A183(-2.211)故EuACOT蛋白的疏水性大于親水性，EuACOT為疏水性蛋白。

圖1 EuACOT與同源序列的比對Fig.1 Alignment homologous sequence of ACOT

圖2 EuACOT蛋白的親水/疏水性的預測Fig.2 Prediction on hydrophobicity/hydrophilicity of EuACOT

2.1.4 EuACOT基因跨膜結構域的預測

利用在線工具TMHMM-2.0對EuACOT氨基酸序列的跨膜結構域進行預測見圖3，EuACOT蛋白N端在細胞膜內的可能性為 0.014 10，預測EuACOT蛋白無跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外。

2.1.5 EuACOT基因二級結構的預測

圖3 EuACOT蛋白的跨膜區(qū)預測Fig.3 Predicted transmembrane of deduced protein of EuACOT

由圖4可知，EuACOT蛋白二級結構中，以螺環(huán)結構(45.43%)和α-螺旋(41.35%)為主，其中螺環(huán)結構(45.43%)＞α-螺旋(41.35%)＞β-折疊(13.22%)，故推測EuACOT為混合型蛋白質。

2.1.6 EuACOT的三級結構的預測

采用auto mode建模方式以蛋白模板(2ib8D)對EuACOT蛋白進行同源建模（見圖5），EuACOT蛋白的三維空間模型。推導EuACOT蛋白模型分值為0.56，蛋白序列的相似性為46.99%。

2.1.7 EuACOT氨基酸序列分子系統(tǒng)進化分析

圖4 預測EuACOT蛋白的二級結構Fig.4 Prediction on secondary structure of EuACOT

圖5 EuACOT蛋白三級結構預測Fig.5 Prediction on tertiary structure of EuACOT

系統(tǒng)進化分析是研究物種進化和系統(tǒng)分類的一種方法，研究對象為攜帶遺傳信息的生物大分子序列，通過序列同源性的比較，采用特定的數(shù)理統(tǒng)計算法來計算生物間的生物系統(tǒng)發(fā)生的關系。利用MEGA5比較不同物種的ACOT基因的氨基酸序列，構建了系統(tǒng)進化樹（見圖6、7），在聚類分析中可以看出，EuACOT蛋白與煙草和番茄的ACOT蛋白在聚類分析圖的距離較近，說明在進化遺傳中杜仲、煙草和番茄的親緣關系較近，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖值，ACOT基因進化關系復雜多樣，不同物種的ACOT基因于多為不同的類群。

2.2 EuHMGS基因的生物信息學分析

2.2.1 EuHMGS基因的理化性質的預測與分析

EuHMGS(Unigene17165)氨基酸序列與茶樹Camellia sinensis（AFC34137.1）、喜樹Camptotheca acuminata（ACD87446.1）、龍蕃茄紅素Solanum lycopersicum（XP_004252572.1）的HMGS氨基酸序列的相似性分別為90%、88%、88%（見圖8）。EuHMGS基因全長cDNA長度為1 356 bp，編碼452個氨基酸，其中絲氨酸(9.7%)＞丙氨酸(9.2%)＞亮氨酸(7.7%) 3個氨基酸含量最高，EuHMGS蛋白相對分子量為50.20 kD，理論等電點為6.04；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為40.17，故屬于不穩(wěn)定蛋白質。

圖6 EuACOT蛋白的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of EuACOT

圖7 EuACOT系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of EuACOT

2.2.2 EuHMGS基因疏水性/親水性的預測

Expasy Protscale程序分析EuHMGS蛋白親水性/疏水性的結果如圖9所示，EuHMGS蛋白氨基酸殘基中以A169疏水性最強(2.389)，以A396親水性最強(-2.566)，疏水氨基酸的數(shù)量的數(shù)量大于親水氨基酸，故EuHMGS推斷為疏水性蛋白。

圖9 EuHMGS蛋白的親水/疏水性的預測Fig.9 Prediction on hydrophobicity/hydrophilicity of EuHMGS

2.2.3 EuHMGS編碼蛋白的疏水/親水性分析

EuHMGS蛋白的疏水/親水性預測的結果如圖9所示，EuHMGS蛋白氨基酸殘基中A169(2.389)疏水性最強，以A396(-2.566)親水性最強，A169(2.389)＞A396(-2.566)故疏水性大于親水性，EuHMGS為疏水性蛋白。

2.2.4 EuHMGS基因跨膜結構域的預測

利用在線工具TMHMM-2.0對EuHMGR氨基酸序列的跨膜結構域進行預測見圖10，EuHMGS蛋白N端在細胞膜內的可能性為 0.019 21，EuHMGS蛋白無跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外。

圖10 EuHMGS蛋白的跨膜區(qū)預測Fig. 10 Predicted transmembrane of deduced protein of EuHMGS

2.2.5 EuHMGS基因二級結構的預測

由圖11可知，EuHMGS蛋白二級結構以螺環(huán)結構(49.78%)和α-螺旋占(38.05%)為主，其中螺環(huán)結構(49.78%)＞α-螺旋占(38.05%)＞β-折疊占(12.17%)，屬于混合型結構的蛋白質。

圖11 EuHMGS蛋白的二級結構的預測Fig.11 Prediction on secondary structure of EuHMGS

2.2.6 EuHMGS的三級結構的預測

采用auto mode建模方式以蛋白模板(2f82A)對EuHMGS蛋白進行同源建模（見圖12），EuHMGS蛋白的三維空間模型。推導EuACOT蛋白模型分值為0.7，蛋白序列的相似性為83.96%。

2.2.7 EuHMGS氨基酸序列分子系統(tǒng)進化分析

利用MEGA5比較不同物種的ACOT基因的氨基酸序列，構建了系統(tǒng)進化樹（見圖13、14），在聚類分析中可以看出，EuHMGS蛋白與茶HUMGS蛋白在聚類分析圖的距離較近，說明在進化遺傳中杜仲與茶的親緣關系較近，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖值，HUMGS基因進化關系復雜多樣，不同物種的ACOT基因于多為不同的類群。

圖12 EuHMGS蛋白三級結構預測Fig.12 Prediction on tertiary structure of EuHMGS

圖13 EuHMGS蛋白的聚類分析Fig.13 Cluster analysis of EuHMGS

2.3 EuHMGR基因的生物信息學分析

2.3.1 EuHMGR基因的理化性質的預測與分析

圖14 EuHMGS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.14 EuHMGS phylogenetic tree

EuHMGR（Unigene5369）氨基酸序列與杜仲Eucommia ulmoides（AY796343.1 ）、 葡 萄Vitis vinifera（XM_002275791.2）、刺五加Eleutherococcus senticosus（AFM77981.1 ）基酸序列的相似性分別為99%、82%、79%（見圖15）。EuHMGR9基因全長cDNA為1 770 bp，編碼590個氨基酸，氨基酸組成中亮氨酸（9.8%）＞絲氨酸（9.8%）＞丙氨酸（9.5%）這3種氨基酸含量較高，EuHMGR蛋白的相對分子量為63.30 kD，理論等電點為6.83，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為44.64，屬于不穩(wěn)定蛋白質。

圖15 EuHMGR與同源序列的比對Fig.15 Alignment homologous sequence of HMGR

2.3.2 EuHMGR基因疏水性/親水性的預測

EuHMGR蛋白的疏水/親水性預測的結果如圖16所示，EuACOT蛋白氨基酸殘基中A398(2.822)疏水性最強，以A73(-2.667)親水性最強，A398(2.822)＞A73(-2.667)故EuACOT蛋白的疏水性大于親水性，EuACOT1為疏水性蛋白。

2.3.3 EuHMGR基因跨膜結構域的預測

圖16 EuHMGR蛋白的親水/疏水性的預測Fig.16 Prediction on hydrophobicity/hydrophilicity of EuHMGR

圖17 EuHMG蛋白的蛋白的跨膜區(qū)預測Fig.17 Predicted transmembrane of the deduced protein of EuHMGR

利用在線工具TMHMM-2.0對EuHMGR氨基酸序列的跨膜結構域進行預測見圖17，EuHMGR蛋白N端在細胞膜內的可能性為0.009 97，在N-末端附近有兩個跨膜區(qū)共有兩個較明顯的跨莫螺旋結構（見圖6）。其中EuHMGR的跨膜區(qū)為TMhelix1(46-68)、TMhelix2(89-111)均含有 22個氨基酸殘基。

2.3.4 EuHMGS基因二級結構的預測

如圖18，EuHMGR蛋白二級結構中，其中螺環(huán)結構(44.24%)和α-螺旋(42.88%)為主，螺環(huán) 結 構 (44.24%)＞ α-螺 旋 (42.88%)＞ β-折 疊(12.88%)，故推測EuACOT為混合型蛋白質。

圖18 預測EuHMGR蛋白的二級結構Fig.18 Prediction on secondary structure of EuHMGR

2.3.5 EuHMGR的三級結構的預測

采用auto mode建模方式以蛋白模板(2q6bA)對EuHMGR蛋白進行同源建模（見圖19），EuHMGR蛋白的三維空間模型，推導EuACOT蛋白模型分值為0.63，蛋白序列的相似性為55.37%。

圖19 EuHMGR蛋白三級結構預測Fig.19 Prediction on tertiary structure of EuHMGR

2.3.6 EuHMGR氨基酸序列分子系統(tǒng)進化分析

利用MEGA5中Clustal W法對不同物種HMGR氨基酸序列進行比對，并用Neighborjoining法構建了系統(tǒng)進化樹（見圖17、圖18）。結果表明不同來源的HMGR蛋白序列在進化上分屬于不同的分類群，說明其進化關系較為復雜。EuHMGR蛋白與杜仲的HMGR蛋白間的親緣關系最為接近。

利用MEGA5比較不同物種的HMGR基因的氨基酸序列，構建了系統(tǒng)進化樹（見圖20、21）。在聚類分析中可以看出，EuHMGR蛋白與杜仲的HMGR蛋白在聚類分析圖的距離較近，說明在進化遺傳中與杜仲的親緣關系較近，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖值，HMGR基因進化關系復雜多樣，不同物種的ACOT基因于多為不同的類群。

圖20 EuHMGR蛋白的聚類分析Fig.20 Cluster analysis of EuHMGR

3 討論與結論

圖21 EuHMGR系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.21 EuHMGR phylogenetic tree

乙 酰CoA酰 基 轉 移 酶 (acetyl-CoA C-acetyltransferase, ACOT) 是萜類化合物生物合成甲羥戊酸 (MVA)途徑的起始酶，對EuACOT基因序列進行同源性分析和分子進化分析表明EuACOT是一種與植物類異戊二烯MVA途徑相關的蛋白；生物信息學分析表明EuACOT基因全長cDNA為1 248 bp，編碼416個氨基酸，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白，無明顯的跨膜區(qū)，二級結構以α-螺旋和螺環(huán)結構為主的混合型結構，進化關系多樣復雜，不同來源的ACOT蛋白屬于不同的類群，其中與杜仲ACOT關系較為親近的為煙草和栽培番茄ACOT基因。

HMG-COA合酶的催化涉及到許多反應，如乙酰化反應、縮合反應和水解反應等，這些反應的模式類似Bi- Bi-Ping-Pong的形式[14-15]。HMGCOA合酶氨基酸有天冬酰胺、半胱氨酸、組氨酸的保守的氨基酸[16]。 羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因(HMGS)是MVA 途徑中的一個非常重要的代謝酶，目前，已經(jīng)在橡膠樹和擬南芥等植物中對HMGS基因進行了分離克隆和表達分析以及功能鑒定，但關于杜仲HMGS基因的相關信息卻尚未見公開報道[17-18]。文章對甲羥戊酸途徑的關鍵酶基因HMGR進行生物信息學分析：EuHMGS基因全長cDNA為1 356 bp，編碼452個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的疏水性蛋白，無跨膜區(qū)，二級結構是以α-螺旋和螺環(huán)結構為主的混合型結構，不同物種的HMGS蛋白序列屬于不同類群。羥甲基戊二酰CoA還原酶( HMGR) 調控類異戊二烯物質合及代謝過程，在確定“碳流”和萜類物質合成產物比例分配調節(jié)中HMGR合酶起到了至關重要的作用[19-20]。在目前現(xiàn)有的研究中，提高萜類物質有效成分的含量主要是通過植物轉基因技術，即通過基因槍、葉盤法、花粉通道法等將基因轉入到目地的植物中，比如將橡膠中的HMGR基因轉入煙草中，可使煙草HMGR活性提高，同時，煙草中的甾醇含量也有所增加[21]。本文對甲羥戊酸途徑的關鍵酶基因HMGR進行生物信息學分析，結果表明EuHMGR基因全長cDNA為1 770 bp，編碼590個氨基酸，不穩(wěn)定的疏水性蛋白，有兩個較明顯的跨膜區(qū)，二級結構均是以α-螺旋和螺環(huán)結構為主的混合型結構，EuHMGR蛋白與杜仲的HMGR蛋白間的親緣關系最為接近。

類萜生物合成途徑是生物體內主要的代謝途徑之一，本研究采用轉錄組測序方法，對杜仲MVA途徑相關基因通過生物信息學方法分別從核苷酸和蛋白質序列水平上, 分析了該基因的特征,為預測杜仲膠合成過程中的功能提供了指導, 也為揭示杜仲膠合成規(guī)律和杜仲的分子育種提供了理論依據(jù)和科學基礎。

[1] 趙德剛,韓玉珍,傅永福,等.杜仲膠生物合成蛋白質的研究[J].中國農業(yè)大學學報, 1999 ,4(1):114.

[2] 杜紅巖.我國的杜仲膠資源及其開發(fā)潛力與產業(yè)發(fā)展思路[J].經(jīng)濟林研究,2010, 28(3): 1-6.

[3] 杜紅巖,王俊鴻,杜蘭英,等.杜仲感技術產品的研究與開發(fā)[J]. 經(jīng)濟林研究,2001,19(2): 18-21.

[4] 張 琳,譚曉風,胡 嬌,等.油茶乙酰CoA?；D移酶基因cDNA克隆及序列特征分析[J].中南林業(yè)科技大學學報,2011, 31(8):108-112.

[5] 崔光紅,王學勇,馮 華,等.丹參乙酰CoA?；D移酶基因全長克隆和SNP分析[J]. 藥學學報 ,2012, 45(6):85-790.

[6] 周憲林.甲基茉莉酸對喜樹中HMGS基因表達的影響初探[J].井岡山醫(yī)專學報, 2009, (16) :6.

[7] Ayte J, Gil-Gomez G, Haro D,et al.Rat mitochondrial and cytosolic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthases are eneoded by two differentgenes [J]. Proe Natl Acad Sci USA.1990, 87(10):3874-3878.

[8] Masearo C,Buesa C, Ortiz J A,et al.Moleeular cloning and tissue expression of human mitoehondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthases[J]. Arch Bioehem BioPhys, 1995, 10(2): 385-390.

[9] Suwanlnaneel P, Slrinupong N, Suvachlttanont W. Regulation of the expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthases inHevea brasiliensis(B.H.K.) Mull. Arg[J]. Plant Sci, 2004, 166:531-537.

[10] 陳大華,葉和春,李國鳳,等.馬鈴薯HMGR基因的克隆、序列分析及其表達特征[J].植物學報, 2000 ,42(7):724-727.

[11] Korth L K, Stermer B A, Bhattacharyya M K,et al.HMG_CoA reductase gene families that differentially accumulate transcripts in potato tubers are developmentally expressed in floral tissues[J]. Plant Mol Biol. ,1997 , 33: 545-551.

[12] Chot D. Differential inductin and suppression of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductace genes in respose to Phytophora infestans and to its ehenor acachidonic acid [J]. Plant Cell ,1993, 4:1333-1344.

[13] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲幼果和成熟果實轉錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(10): 9-17.

[14] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲果實和葉片轉錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報, 2012, 32(11):22-130.

[14] Middleton B. The kinetic mechanism of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthases from baker’s yeast [J]. Bioehem Journal, 1972, 126(l):35-47.

[15] Miziorko HM, Clinkenbeard KD, Reed WD, et al. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthases Evidence for anacetyl-S-enzyme intermediate and ideniifieation of a cysteinyl sulthydryl as the site of acetylation [J]. J. Biol. Chem., 1975 10(15):5768-73.

[16] Priee A C, ChoiK-H, Health R J, et al. Inhibition of b-ketoacylacyl carrier protein synthases by thiolaetomyein and cerulenin Structure and meehanism[J]. J. Biol. Chem., 2001,276:6551-6559.

[17] 費小雯, 鄧曉東, 胡新文,等.橡膠延伸因子基因及3-端非編碼區(qū)的克隆與序列分析[J]. 生命科學研究,1999 ,(4):15-18.

[18] 王鳳華,劉文鋒.擬南芥HMGs家族成員全基因組分析[J].安徽農業(yè)科學, 2012,40(36) : 17478-17481.

[19] Dai Z B, Cui G H, Zhou S F, et al. Clong and characterixation of a novel 3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhiza involved in diterpenoid transhinone accumulation[J]. J. Plant Physiol, 2001, 168:148-157.

[20] 武 瑩,李 威,祝傳書.雷公藤HMGR基因克隆、序列分析及誘導表達[J].西北農業(yè)科技大學學報:自然科學版,2012,40(11): 103-111.

[21] 王啟超, 劉實忠, ?，F(xiàn)周.橡膠HMGR基因的克隆及表達分析[J].植物研究,2012, (1):61-68.

Study on full length cDNA of MVA pathway related genes in Eucommia ulmoides

WANG Lin1a,b, WUYUN Ta-na2, LIU Hui-min1a,b, YE Sheng-jing1a,b, DU Hong-yan2
(1a. Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry; b.School of Forestry, Central South University of Forestry & Technology,Changsha 410004, Hunan, China; 2.Non - timber Forestry Research and Development Center, CAF, Zhengzhou 450003, Henan, China)

This analysis was based on data of the transcriptome sequencing ofEucommiayoung fruit and mature fruit. The terpene synthesis of MVA pathway involving of 30 Unigene. We identif i ed 3 full-length cDNA in MVA pathway of young fruit and mature fruit, These full-length cDNA were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects: composition of the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence, transmembrane structure, hydrophobicity or hydrophilicity, secondary and tertiary structure of protein, molecular phylogenetic evolution and so on.The results are as follows: Full-length cDNA of EuACOT gene has 1 248 bp, and coded 416 aa, EuACOT is stable hydrophobic protein without transmembrane domain, and belong to different taxa in evolution, high consistency with theNicotiana tabacumandLycopersicon esculentumin ACOT protein sequences and high structure.Full-length cDNA of EuHMGS gene has 1 356 bp, and coded 452 aa, EuHMGS is unstable hydrophobic proteins without transmembrane domain, and high consistency with theCamellia sinensisin HMGR protein sequences and high structure. Full-length cDNA of EuHMGR gene has 1 770 bp, and coded 590 aa, EuHMGR is unstable hydrophobic proteins with two transmembrane domanin, and high consistency with theEucommia ulmoidesin HMGR protein sequences and high structure. The secondary structures of above three proteins are predominantly hybrid structure of alpha helical and spiral ring structure and belong to different taxa in evolution.

Eucommia ulmoidesOliv; terpenes; MVA pathway; sequence analysiss; bioinformatics

S727.34

A

1673-923X(2014)01-0094-09

2013-05-25

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004029）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD21B0502）

王 淋（1986-），女，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事生經(jīng)濟林遺傳育種研究

烏云塔娜（1975-），女，內蒙古通遼人，教授，主要從事經(jīng)濟林育種栽培的研究；E-mail：tanatanan@sina.com

[本文編校：吳 毅]