熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度評定的探討

蔣玲麗，王雪亮，肖艷群，王華梁

(上海市臨床檢驗中心，200126)

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前國內(nèi)乙型肝炎病毒(HBV)檢測應(yīng)用最廣泛的方法。臨床對HBV患者體內(nèi)病毒復(fù)制水平或臨床抗病毒治療效果判斷普遍憑借臨床經(jīng)驗，HBV DNA降低1～2個數(shù)量級被認(rèn)為抗病毒治療有效，但這種經(jīng)驗方法缺乏實驗數(shù)據(jù)支撐，1個可靠的檢測結(jié)果還必須依賴不確定度為臨床提供準(zhǔn)確的參考[1]。測量不確定度代表測量結(jié)果的分散性，是1個反映測量結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)。近年來，不確定度概念逐漸引入臨床檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。不確定度通?？赏ㄟ^“模式辦法”和“經(jīng)驗辦法[2]”來評定。對于臨床實驗室檢驗，影響檢驗結(jié)果或與檢驗結(jié)果有關(guān)的因素很多，其測量不確定度評定仍存在許多有待澄清的問題。臨床實驗室中不確定度的合理評定和應(yīng)用，仍需要一定的實踐、探討和一定的約定。本單位承擔(dān)著上海市醫(yī)療結(jié)構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量監(jiān)管、指導(dǎo)和服務(wù)職能，探討既簡便又可信的評定PCR測定HBV DNA不確定度方法對臨床實驗室開展相關(guān)工作具有借鑒意義。本文參考文獻[3]采用“經(jīng)驗辦法”對實驗室的HBV DNA項目測量不確定度進行了評定，探討其可行性。

材料和方法

一、材料

1.檢測儀器 瑞士Roche公司的lightcycler實時熒光定量檢測儀、杭州博日HB-100型恒溫金屬浴、德國Biofuge-Fresc O高速冷凍離心機。

2.檢測試劑 上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號20111212。嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

3.樣品 取2例臨床確診乙型肝炎患者血清，用于批內(nèi)重復(fù)性實驗。取上海市地區(qū)性室內(nèi)質(zhì)控品2個濃度，批號1201，用于批間重復(fù)性實驗。

二、方法

1.測量不確定度的評定程序 利用實驗室提供的方法學(xué)性能驗證數(shù)據(jù)評定A類不確定度，分別用參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心和美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)組織的HBV DNA室間質(zhì)評數(shù)據(jù)評定B類不確定度;本研究中所有不確定度分量全部采用標(biāo)準(zhǔn)不確定度(即標(biāo)準(zhǔn)差)表示;分別評定測量觀測值個數(shù)n=1、2、3 3種情況下的合成不確定度和擴展不確定度。

2.不確定度A類評定 實驗室可提供的方法性能參數(shù)包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。(1)批內(nèi)重復(fù)性分析:以不同濃度水平的2例乙型肝炎患者血清標(biāo)本，重復(fù)檢測20次，計算2個濃度水平的批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差[s(w)];由批內(nèi)重復(fù)性引起的不確定度為測量觀測值個數(shù);(2)批間重復(fù)性分析:根據(jù)HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控物高低2個濃度2012年23批次室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，分別求得2個濃度水平的批間標(biāo)準(zhǔn)差[s(b)];由批間重復(fù)性引起的不確定度。

3.不確定度B類評定 室間質(zhì)量評價活動。根據(jù)本室參加2012年衛(wèi)生部臨床檢驗中心和CAP HBV DNA室間質(zhì)評結(jié)果，統(tǒng)計每個結(jié)果與靶值的差值(dn)，計算差值的平均值(dm)及其標(biāo)準(zhǔn)差由 u(bias)的大小來估計由方法偏倚(系統(tǒng)效應(yīng))導(dǎo)致的不確定度。另外，由于超出測定范圍樣品稀釋導(dǎo)致的不確定度亦歸不確定度B類統(tǒng)計，樣品稀釋檢測不在本研究范圍。

4.合成不確定度和擴展不確定度的評定根據(jù)公式確定合成不確定度擴展不確定度(U)為uc乘以包含因子(k)，取P=95%置信區(qū)間時

5.每次實驗均做室內(nèi)質(zhì)控，當(dāng)質(zhì)控結(jié)果在控時，實驗數(shù)據(jù)才能采用，否則，應(yīng)重新進行檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計均將初始濃度值QDNA進行對數(shù)轉(zhuǎn)化為LGQ后計算。統(tǒng)計結(jié)果小數(shù)點后保留4位有效數(shù)字。

結(jié) 果

一、PCR測定HBV DNA 2種濃度水平，計算由批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度分量見表1。

表1 批內(nèi)和批間重復(fù)性引起的不確定度分量

二、PCR測定HBV DNA，通過2012年參加的衛(wèi)生部和CAP反饋的室間數(shù)據(jù)，計算由方法偏倚因素引起的不確定度結(jié)果見表2。

三、PCR測定HBV DNA合成不確定度與擴展不確定度評定。見表3和表4。

討 論

由7個國際著名學(xué)術(shù)組織頒布的在計量學(xué)上有深遠影響的標(biāo)準(zhǔn)“測量不確定度表示導(dǎo)則(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，簡稱GUM)”，對測量不確定度評定與表示的一般規(guī)則作出了規(guī)定和說明[4]。用于實驗室認(rèn)可的國際標(biāo)準(zhǔn)主要是ISO17025和ISO15189，中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)等同采用這些標(biāo)準(zhǔn)(CNAS-CL01和CNAS-CL02)，用于中國實驗室認(rèn)可。2個標(biāo)準(zhǔn)均要求測量結(jié)果的不確定度。隨著實驗室認(rèn)可的逐漸推廣，不確定度概念逐漸引入醫(yī)學(xué)實驗室和臨床檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。PCR是目前國內(nèi)HBV DNA檢測應(yīng)用最廣泛的方法。在臨床應(yīng)用中，同一實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同一標(biāo)本檢測結(jié)果的差異，已成為困擾臨床醫(yī)師、患者及實驗室技術(shù)人員的普遍問題。臨床醫(yī)生提出檢測結(jié)果的不一致究竟是患者病毒載量的真正變化還是由檢測系統(tǒng)本身引起的差異，應(yīng)該加以辨別。臨床實驗室必須在充分了解PCR測定的不確定性的基礎(chǔ)上，采取相應(yīng)質(zhì)控措施，才能確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，而不致出現(xiàn)判斷失誤。

表2 方法偏倚不確定度

表3 合成不確定度與擴展不確定度(衛(wèi)生部室間數(shù)據(jù)評定)

表4 合成不確定度與擴展不確定度(CAP室間數(shù)據(jù)評定)

目前國內(nèi)PCR測定主要依靠手工進行核酸提取，整個操作步驟繁多。有國內(nèi)學(xué)者指出PCR測定HBV DNA的不確定度來源包括:模板制備過程中的標(biāo)本濃縮和核酸提取來源的不確定度、擴增反應(yīng)體系來源的不確定度、數(shù)據(jù)處理的不確定度、相關(guān)儀器設(shè)備(如熱循環(huán)儀和移液器等)的不確定度[5]。根據(jù)不確定度來源計算每一組分的不確定度，稱為“模式辦法”;對臨床實驗室來說，不易掌握[6]，在實際的應(yīng)用過程中也不可行。國內(nèi)有學(xué)者提出簡化的不確定度來源計算方式，即“經(jīng)驗辦法”，以此制定符合臨床實驗室實際操作的不確定度評定方法[2，7]。我們實驗室采用“經(jīng)驗辦法”對HBV DNA項目的不確定度評定進行了探討。首先，收集了實驗室開展HBV DNA檢測項目之前就需完成的批內(nèi)不精密度、批間不精密度等性能驗證的數(shù)據(jù)。通過這些數(shù)據(jù)進行不確定度 A類評定，本實驗室104～105和106～107U/mL計算的批內(nèi)不精密度分別為3.13%和1.42%，批間不精密度分別為 4.23% 和 3.52%(未在文中列出)，上海市各醫(yī)療機構(gòu)的PCR實驗室每月上報至本中心的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，HBV DNA濃度為104～105和106～107IU/mL，其室內(nèi)質(zhì)控不精密度在3%～5%之間，說明本實驗室性能驗證的數(shù)據(jù)可以接受，代表了目前大多數(shù)實驗室的不精密度水平。由此評定的A類不確定度從表1可以看出，在n=1時HBV DNA的檢測濃度在104～105和106～107IU/mL時，評定得到的u(w)分別為0.136 9 和0.084 3，u(b)分別為0.205 3 和0.236 7;這也和文獻[3]計算的數(shù)據(jù)比較接近。這說明本實驗室評定的A類不確定度和其他實驗室接近。

另外，本實驗室同時參加了衛(wèi)生部臨床檢驗中心和CAP組織的室間質(zhì)評，通過室間質(zhì)評數(shù)據(jù)評定B類不確定度，以此來估計由方法偏倚(系統(tǒng)效應(yīng))導(dǎo)致的不確定度。由于室間質(zhì)評的頻次和數(shù)據(jù)較少，在評定B類不確定度時，我們未按檢測樣品濃度分組統(tǒng)計。2012年衛(wèi)生部臨床檢驗中心共組織2次室間質(zhì)評，通過7個陽性標(biāo)本計算得到的方法偏倚導(dǎo)致的B類不確定度為0.099 7;2012年CAP組織3次室間質(zhì)評，通過5個陽性標(biāo)本計算得到的方法偏倚導(dǎo)致的B類不確定度為0.430 8;通過2個不同機構(gòu)組織的室間質(zhì)評數(shù)據(jù)評定B類不確定度數(shù)據(jù)差異較大。從表3和表4可以看出，當(dāng)HBV DNA的檢測濃度在104～105和 106～107IU/mL，n=1，k=1.96時，通過衛(wèi)生部室間質(zhì)評數(shù)據(jù)計算，其擴展不確定度分別為0.521 6和0.529 8;通過CAP室間質(zhì)評數(shù)據(jù)計算，其擴展不確定度分別為0.973 1和0.977 5。同一實驗室，通過不同機構(gòu)的室間數(shù)據(jù)來源評定B類不確定度，其得出的擴展不確定度竟相差0.451 5～0.447 7。主要原因在于:2個機構(gòu)對HBV DNA項目的評價方式不同，CAP組織HBV DNA室間質(zhì)評項目以方法組的均值作為靶值;衛(wèi)生部臨檢中心采用溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品得出的檢測值作為靶值，并不對檢測試劑進行分組，而不同品牌試劑檢測結(jié)果存在較大差異。由此可見，雖然采用“經(jīng)驗辦法”評定 PCR測定 HBV DNA的不確定度簡便易行，但采用室間質(zhì)評數(shù)據(jù)評定不能反映實驗室真實的測量不確定度。如果使用HBV DNA國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評定B類不確定度，可避免由于評價方式的不同造成的B類不確定度的差異。在日常檢驗工作中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將極大的改善不同實驗室間檢驗結(jié)果的可比性，從而逐步實現(xiàn)不同實驗室間檢驗結(jié)果有條件的互認(rèn)[8]。目前，已有國內(nèi)學(xué)者[9]提出采用測定國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評定不確定度，并指出在同一實驗室內(nèi)或不同實驗室間HBV DNA測定結(jié)果進行比較或互認(rèn)時，引入“不確定度報告”使結(jié)果具有可比性。上海市臨床檢驗中心是上海市衛(wèi)生局授權(quán)開展全市醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室質(zhì)量監(jiān)管、指導(dǎo)和服務(wù)的技術(shù)支撐單位，對實驗室不確定度的評定進行探討將對臨床實驗室開展相關(guān)工作具有一定借鑒作用。本實驗室將在后續(xù)的研究中采用國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測，力求尋找一種臨床實驗室既簡便又可信的評定PCR測定HBV DNA的不確定度的方法。

綜上所述，“經(jīng)驗辦法”評定PCR測定HBV DNA的不確定度雖然簡便易行，但利用室間質(zhì)評數(shù)據(jù)評定，由于其評價方式不同不能準(zhǔn)確真實地反映實驗室不確定度?？梢赃M一步探討采用檢測國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)評定PCR測定HBV DNA的不確定度。

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