小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系的建立

王雪芳，王春梅，張金林，段麗婕，王鎖民＊

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730020；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州730050）

＊小花堿茅（Puccinelliatenuiflora）又名星星草，屬多年生禾本科堿茅屬草本植物，生長(zhǎng)于草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍［1］，多分布于哈薩克斯坦、阿爾泰到亞庫(kù)梯地區(qū)以及我國(guó)東北、內(nèi)蒙古、華北、西北等地。由于其較強(qiáng)的耐鹽堿性，小花堿茅常成為草原區(qū)鹽化或堿化草甸的優(yōu)勢(shì)種，如今更逐漸成為改良和利用鹽堿地草原草甸的建群種，我國(guó)從20世紀(jì)80年代開始利用小花堿茅改良鹽堿地，取得了良好的效果。小花堿茅不僅可以綠化鹽堿地、改善生態(tài)環(huán)境，而且還可以改善土壤的理化性質(zhì)，為其他農(nóng)作物和牧草栽培提供可生存的環(huán)境，這些優(yōu)點(diǎn)使它成為了生物改良鹽堿地的首選草種之一［2］。

近年來，科學(xué)家們對(duì)小花堿茅的生理生態(tài)特性、對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響、抗鹽堿的解剖結(jié)構(gòu)及離子吸收與分配的生理機(jī)制等方面進(jìn)行了大量的研究［3－7］，亦克隆和鑒定了與其耐鹽性相關(guān)的一批基因［8－11］，但要進(jìn)一步深入分析這些基因在小花堿茅適應(yīng)鹽生境中的作用機(jī)制，尚亟待建立小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系。本研究以小花堿茅成熟種子為外植體，成功建立了完整的小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系，為進(jìn)一步探究其耐鹽堿的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

小花堿茅成熟種子于2009年8月采自蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)田，陰干后置于－20℃冰箱中，次年選取籽粒飽滿的種子備用。

1.2 種子脫穎處理及消毒

選取成熟飽滿的種子置于研缽中，輕研數(shù)下后得到脫穎的褐色種子，分別將脫穎和未脫穎的種子置于超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精消毒3min，再用5%的次氯酸鈉消毒10min，最后用無菌水沖洗3～5次。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

以 MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂（pH 7～8）為基本培養(yǎng)基，分別添加1）3mg／L 2，4－D；2）5mg／L 2，4－D；3）3 mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；4）5mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；5）7mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；6）5 mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA作為愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。然后將消毒后的種子接種于上述培養(yǎng)基上遮光培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種70粒種子，每種培養(yǎng)基10個(gè)重復(fù)。分別在2和4周后觀察、統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況，并選擇生長(zhǎng)良好的愈傷組織繼代2次，繼代周期為4周。

1.4 愈傷組織的分化

以 MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂（pH 7～8）為基本培養(yǎng)基，分別添加1）0.3mg／L 6－BA；2）0.5mg／L 6－BA；3）1.0mg／L 6－BA；4）1.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA；5）1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA；6）3.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA作為愈傷組織的分化培養(yǎng)基。選取直徑約1cm左右生長(zhǎng)良好的黃色顆粒狀胚性愈傷組織接種于上述培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)接10個(gè)愈傷組織塊，每種培養(yǎng)基6個(gè)重復(fù)。分別在2和4周后觀察、統(tǒng)計(jì)芽點(diǎn)分化情況。

1.5 生根培養(yǎng)與移栽

愈傷組織分化出芽點(diǎn)再經(jīng)4周生長(zhǎng)后，移植于1／2MS＋1%蔗糖＋0.7%瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。待組培苗生長(zhǎng)至10cm左右時(shí)，開蓋后煉苗1周，然后將完整的再生植株移栽于營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的基質(zhì)中，并保證溫室濕度，隔天澆水。

1.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度恒定保持（25±1）℃，愈傷組織分化和植株再生階段的光照強(qiáng)度為50μmol／（m2·s），光周期為16h／d。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和顯著性分析，用 Microsoft Excel 2003制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子脫穎處理

種子脫穎后，發(fā)芽率顯著提高，由7.6%增至50.8%，且污染率也有顯著降低（圖1），由此可見種子脫穎對(duì)種子發(fā)芽以及愈傷組織的誘導(dǎo)是至關(guān)重要的。因此，本研究后續(xù)試驗(yàn)采用脫去穎殼的種子為外植體。

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將脫穎的小花堿茅種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3～4d后發(fā)芽，2周后在纖細(xì)的胚芽基部可見白色的愈傷組織，4周后的愈傷組織直徑約3mm左右，呈白色團(tuán)狀，經(jīng)1次繼代后，部分逐漸轉(zhuǎn)化為黃色顆粒狀。愈傷組織誘導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)隨著2，4－D濃度的增加而升高，當(dāng)培養(yǎng)基中2，4－D濃度為5.0mg／L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)55.2%，此后，隨著2，4－D濃度繼續(xù)增加到7.0mg／L時(shí)，反而會(huì)抑制愈傷組織的誘導(dǎo)（表1），同時(shí)，在培養(yǎng)基中添加6－BA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率會(huì)下降，且水化狀態(tài)加重、生長(zhǎng)緩慢。結(jié)果表明，誘導(dǎo)小花堿茅愈傷組織最適的激素配比濃度為5.0 mg／L 2，4－D，不添加6－BA。

表1 不同濃度激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of various hormone ratios on callus induction in P.tenuiflora

2.3 愈傷組織的分化

將小花堿茅胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，2周后開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，隨著6－BA濃度的增加，愈傷組織分化率逐漸提高，當(dāng)6－BA的濃度增加到1.0mg／L時(shí)，分化率最高，達(dá)33.3%，進(jìn)一步提高6－BA濃度至3.0mg／L時(shí)，分化率明顯下降（表2），由此可見促進(jìn)胚性愈傷組織分化的最佳6－BA濃度為1.0mg／L。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加NAA后，分化率雖沒有顯著提高，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分胚性愈傷組織表面都會(huì)分化出許多毛狀根（圖2C），且NAA濃度越高，生根越明顯，其中當(dāng)NAA的濃度為0.5mg／L時(shí)，生根率達(dá)到了81.7%。結(jié)果表明，誘導(dǎo)分化的最適激素濃度配比為0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA。

表2 不同濃度激素配比對(duì)小花堿茅愈傷組織芽分化和生根的影響Table 2 Effects of various hormone ratios on bud differentiation and rooting from callus in P.tenuiflora

2.4 生根和移栽

將分化出芽點(diǎn)并帶有根毛的愈傷組織移入1／2 MS＋1%蔗糖＋0.7%的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)100%，且其根系發(fā)達(dá)（圖2D）。待組培苗生長(zhǎng)至10cm左右時(shí)，開蓋煉苗1周，移栽后全部成活，生長(zhǎng)良好（圖2G）。

圖1 小花堿茅種子脫穎處理對(duì)其發(fā)芽率和污染率的影響Fig.1 Effects of husk－off treatment on seed germination and contamination rates in P.tenuiflora

圖2 小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系Fig.2 Plant regeneration system via tissue culture in P.tenuiflora

3 討論

3.1 種子脫穎處理對(duì)小花堿茅組織培養(yǎng)的影響

小花堿茅種子細(xì)小，呈紡錘形，外包被穎殼。穎殼顯著影響小花堿茅種子的發(fā)芽率，脫去穎殼后，種子發(fā)芽率提高了43.2%，污染率也得到了顯著降低（圖1）。這可能是由于種子穎殼潛伏的微生物使種子消毒困難，穎殼中含有的某種抑制物或穎殼妨礙了種子的呼吸從而抑制了種子的萌發(fā)。趙昕等［12］研究發(fā)現(xiàn)種子穎殼、種皮透性以及種子內(nèi)含有的發(fā)芽抑制物質(zhì)是結(jié)縷草種子休眠的主要原因；馬彩云等［13］研究發(fā)現(xiàn)，野生結(jié)縷草種子去穎后愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著提高；李曉玲等［14］在建立小花堿茅組織培養(yǎng)體系時(shí)也發(fā)現(xiàn)去穎處理能夠得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由此可見，脫穎處理對(duì)以種子為外植體的禾本科植物種子萌發(fā)和愈傷組織培養(yǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。

3.2 不同激素配比對(duì)小花堿茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

生長(zhǎng)素類激素對(duì)禾本科植物的愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的快繁和生根有很重要的作用［14］，2，4－D是禾本科植物組織培養(yǎng)中公認(rèn)的誘導(dǎo)愈傷組織效果最好的生長(zhǎng)素類似物，這在高羊茅（Festucaarundinacea）、早熟禾（Poa）等［15－16］禾本科牧草及農(nóng)作物大麥（Hordeumvulgare）［17］中都得到了證實(shí)，李曉玲等［14］的研究結(jié)果也表明，2，4－D在小花堿茅和朝鮮堿茅愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)中起著重要的作用。一般認(rèn)為以成熟種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)需要較高濃度的2，4－D，且單子葉植物所需2，4－D的濃度是雙子葉的10～20倍［18］，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2，4－D濃度增至5.0mg／L時(shí)，小花堿茅種子的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)55.2%，較李曉玲等［14］研究的愈傷誘導(dǎo)率高1.9%，在2，4－D濃度達(dá)到7.0mg／L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率反而降低到38.6%（表1）。錢海豐和薛慶中［19］的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2，4－D濃度高于12mg／L時(shí)，高羊茅種子愈傷組織的誘導(dǎo)會(huì)受到嚴(yán)重抑制，這可能是因?yàn)樯L(zhǎng)素濃度過高提高了植物組織內(nèi)多酚氧化酶的活性，從而增加了愈傷組織的褐化、降低了愈傷組織的誘導(dǎo)［20］。在植物愈傷組織誘導(dǎo)中，一般配合使用低濃度的細(xì)胞分裂素可提高愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率，本研究中卻得到了相反的結(jié)果：0.1和0.3mg／L 6－BA均在一定程度上抑制了小花堿茅愈傷組織的誘導(dǎo)（表1）。李俊琴等［21］在研究新麥草（Psathyrostachysjuncea）幼胚愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，添加6－BA反而會(huì)抑制其愈傷組織的形成。

3.3 不同激素配比對(duì)小花堿茅胚性愈傷組織分化和生根的影響

NAA是植物組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素類激素之一，在誘導(dǎo)愈傷組織分化時(shí)使用較多，其使用的濃度范圍是0.1～1.0mg／L。有研究報(bào)道禾本科牧草高羊茅和黑麥草（Loliumperenne）在分化時(shí)所用NAA濃度均為0.5 mg／L［20，22］，本研究中也發(fā)現(xiàn)當(dāng) NAA濃度為0.5mg／L時(shí)，小花堿茅分化率最高，達(dá)31.7%（表2）。也有研究報(bào)道NAA不僅有利于愈傷組織芽點(diǎn)的分化，同時(shí)還可促進(jìn)組培苗生根［23］，本研究中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA濃度為0.5 mg／L時(shí)，生根率達(dá)到了81.7%。生長(zhǎng)素濃度低于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)植物芽的形成，且細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用，6－BA是促進(jìn)植物細(xì)胞分裂分化的激素，在愈傷組織分化中起主導(dǎo)作用，其濃度使用范圍為1.0～3.0 mg／L，本研究中發(fā)現(xiàn)0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA的激素配比是誘導(dǎo)小花堿茅愈傷組織分化與生根的最適激素配比，錢海豐和薛慶中［19］也在2.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)了高羊茅芽的分化和生根，本研究與其結(jié)果基本一致。

許多植物組織培養(yǎng)的研究證實(shí)，無任何激素的1／2MS培養(yǎng)基是組培苗生根的最適培養(yǎng)基，它能很大程度地提高組培苗移栽的成活率，本研究結(jié)果與其一致，小花堿茅胚性愈傷組織在1／2MS培養(yǎng)基上的生根率為100%。

4 結(jié)論

小花堿茅組織培養(yǎng)體系以脫穎后的種子為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS＋5.0mg／L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為：MS＋0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂，同時(shí)伴隨大量毛狀根的發(fā)生；生根培養(yǎng)基為：1／2MS＋1%蔗糖＋0.7%瓊脂培養(yǎng)基，生根率可達(dá)100%，且移栽后全部成活。本研究建立的小花堿茅植株再生周期為16周左右。

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