模擬酸雨與Cd對(duì)紫萼膜脂過(guò)氧化及形態(tài)特征的影響

王成聰，高素萍，黃麗，林嘯，張碩，雷霆

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園林研究所，四川 成都611130）

＊植物是城市污染物的一個(gè)重要的匯［1］?？焖俪鞘谢瘜?dǎo)致城市污染加劇，城市植被生態(tài)服務(wù)功能下降。研究城市環(huán)境與城市植被間的相互作用，特別是城市環(huán)境污染對(duì)城市植被的生態(tài)脅迫效應(yīng)已顯得尤為重要。自然狀態(tài)下，絕對(duì)意義上的單一污染是不存在的，污染多具伴生性和綜合性［2］，各因素間可能會(huì)產(chǎn)生加和、協(xié)同或拮抗等作用。酸雨可以影響土壤中重金屬的化學(xué)行為，二者共同導(dǎo)致植物生存條件進(jìn)一步惡化［3］。雖然目前酸雨和重金屬污染對(duì)植被生態(tài)脅迫效應(yīng)的研究已得到充分重視，但多數(shù)研究集中在單一酸雨或重金屬對(duì)植被的脅迫方面，且局限于單因素水平變化產(chǎn)生的表面效應(yīng)。酸雨與重金屬?gòu)?fù)合污染的研究主要集中于農(nóng)作物方面，且并不區(qū)分各脅迫因子對(duì)總體脅迫效應(yīng)的貢獻(xiàn)程度［4］。

紫萼（Hostaventricosa）是百合科玉簪屬多年生草本植物，生物量大且易于繁殖和養(yǎng)護(hù)，已在城市綠化中推廣應(yīng)用。目前，紫萼的相關(guān)研究主要集中在Pb脅迫［5－6］方面，有關(guān)Cd和酸雨單一或復(fù)合污染對(duì)紫萼影響的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。那么，在酸雨與Cd復(fù)合污染的共同作用下，紫萼植株體內(nèi)的膜脂過(guò)氧化及形態(tài)的變化特征，以及這種變化到底是酸雨與Cd傷害效應(yīng)的簡(jiǎn)單加和，還是二者協(xié)同或拮抗作用所致尚不得而知?；谶@樣的假設(shè)和疑問(wèn)，人工模擬酸雨與重金屬Cd的復(fù)合污染條件，研究其對(duì)紫萼植株形態(tài)特征與膜脂過(guò)氧化方面的影響，比較單一與復(fù)合污染對(duì)植物的不同影響，確定二因素間的相互作用類型，并區(qū)分各脅迫因子對(duì)總體脅迫效應(yīng)的貢獻(xiàn)程度，討論引起表面效應(yīng)的微觀過(guò)程，找出引起植物受害的污染強(qiáng)度閾值，以期為城市綠化凈化植物材料選擇與城市植被生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)等實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料選擇三年生紫萼實(shí)生苗，為2010年3月種子萌發(fā)所得，種子采自雅安市碧峰峽大熊貓基地。選取其中長(zhǎng)勢(shì)良好且基本一致的實(shí)生苗，于2012年10月提前轉(zhuǎn)移至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)苗圃順利越冬。

1.2 配制盆土

將采集的土壤（園土）和腐殖土自然風(fēng)干，碾碎并剔除雜物后進(jìn)行研磨，過(guò)5mm篩，二者按比例1∶1混合均勻，用80%多菌靈1000倍液消毒，密封堆放30d備用?；旌贤粱纠砘再|(zhì)如下：pH值6.5，Cd背景含量為0.466mg／kg，全氮（N）0.68g／kg，全磷（P）0.55g／kg，全鉀（K）3.24g／kg，有機(jī)碳（C）36.49g／kg，陽(yáng)離子交換量（CEC）17.83cmol／kg。

1.3 外源Cd處理

根據(jù)國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和成都平原重金屬污染情況，并通過(guò)一系列預(yù)試驗(yàn)，最終確定盆土5個(gè)Cd濃度梯度分別為0，10，30，50，100mg／kg（以Cd2＋離子含量計(jì)）。其具體配制方法如下：用分析天平稱取20.3149g分析純?cè)噭〤dCl2·2.5H2O，用超純水（RO）定容至1L的容量瓶配成母液備用。處理時(shí)，用量程為5000μL的移液槍分別吸取母液0，1000，3000，5000，10000μL，定容至5個(gè)200mL的容量瓶中，制成每瓶分別含有0，10，30，50，100mg的Cd污染處理液（以Cd2＋離子含量計(jì)）。由于試驗(yàn)中每盆稱取的混合土重為2kg，故每個(gè)梯度濃度的Cd處理液需重復(fù)噴淋加入1次。其中，以不添加Cd2＋的土壤作為對(duì)照（CK）。

1.4 模擬酸雨處理

模擬酸雨溶液的配制參照麥博儒等［7］的方法并加以改進(jìn)，根據(jù)成都市溫江區(qū)氣象局提供的氣象觀測(cè)資料，參考成都市近年來(lái)的降水主要離子組成及濃度［8］，同時(shí)考慮到自然降水離子濃度的不確定性以及試驗(yàn)的可操作性，通過(guò)計(jì)算最終確定模擬酸雨溶液中各主要離子濃度（表1）。

表1 模擬酸雨各主要離子成分Table 1 Main ion concentrations of the mixed simulated acid rain μmol／L

精確稱取分析純?cè)噭〤aCl2（1.6225g）、（NH4）2SO4（1.0228g）、MgSO4·7H2O（0.6581g）、KNO3（0.3508 g）、NaF（0.1122g），用超純水分別定容至100mL容量瓶制成濃溶液，用量程為1000μL移液槍分別吸取濃溶液1mL，再用超純水分別定容至100mL容量瓶作為稀釋液，然后將5種稀釋液依次加入1L容量瓶中混勻，用超純水定容至刻度線；再以0.05mol／L稀鹽酸溶液進(jìn)行pH 值分別為6.5，5.5，4.5，3.5，2.5的標(biāo)定，即為試驗(yàn)所用的模擬酸雨處理液。CaCl2和稀鹽酸的加入也意味著有一定數(shù)量的Cl－加入，但每次噴施的Cl－總量（10－6mol數(shù)量級(jí)）與土壤中Cl－相比較少，且低濃度Cl－不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。各處理離子組成濃度最終以ICS－2100離子色譜儀（DIONEX，Sunnyvale，USA）測(cè)定為準(zhǔn)。

酸雨的臨界pH為5.6，各酸雨梯度pH 分別模擬極強(qiáng)酸雨（extreme AR，pH＝2.5）、強(qiáng)酸雨（strong AR，pH＝3.5）、較強(qiáng)酸雨（moderate AR，pH＝4.5）、弱酸雨（weak AR，pH＝5.5）以及對(duì)照（CK，pH＝6.5）。用小型噴霧器仿照自然降水，每隔3d分別噴淋1次各pH模擬酸雨溶液，每次每盆100mL。

1.5 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用二因素五水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共25個(gè)處理組合（表2）。每個(gè)處理組合重復(fù)3次，即75盆，每盆栽2株，共150株紫萼。

2013年3月28日，隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且相近的三葉期紫萼，剪去腐爛的根系，用清水沖洗干凈后蘸取80%多菌靈800倍液消毒后，栽植于20cm×15cm×15cm盆中，每盆稱取2kg混合土?；ㄅ柘乱r墊托盤，將土壤滲出液倒回盆內(nèi)，以防止土壤中重金屬Cd流失。分株15d后，待苗木長(zhǎng)勢(shì)恢復(fù)良好后即開(kāi)始試驗(yàn)處理。大棚內(nèi)外溫濕度基本一致，遮陰網(wǎng)遮光率為85%。

表2 Cd和模擬酸雨復(fù)合處理組合Table 2 The treatment combination of Cd and simulated acid rain

1.6 指標(biāo)測(cè)定

處理30d后，測(cè)試鮮樣隨機(jī)采自每個(gè)處理植株的第3～5片葉，采用打孔法從每株紫萼取3個(gè)樣本來(lái)進(jìn)行各生理指標(biāo)的測(cè)定。由于紫萼葉片可見(jiàn)傷害的出現(xiàn)明顯滯后于其他生理指標(biāo)，故該指標(biāo)的測(cè)定安排到試驗(yàn)的后期進(jìn)行，以印證試驗(yàn)前期各生理指標(biāo)對(duì)Cd和酸雨復(fù)合污染的響應(yīng)，具體取樣時(shí)間為處理后的第60天。

1.6.1 可見(jiàn)壞死百分比 葉片圖像由數(shù)碼相機(jī)Canon IXUS 130拍攝，葉片壞斑點(diǎn)的總面積以及總的葉面積均由軟件Adobe Photoshop 3.0統(tǒng)計(jì)，可見(jiàn)壞死百分比表示為壞死面積與總?cè)~面積的百分比，詳見(jiàn)肖強(qiáng)等［9］的方法。

1.6.2 MDA和ROS（活性氧）含量 MDA測(cè)定參照李合生［10］的方法。H2O2測(cè)定參照Patterson等［11］的方法；測(cè)定采用高俊鳳［12］的方法。

1.6.3 SOD和CAT活性 SOD活性測(cè)定采用NBT光還原法［10］；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法［10］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用兩因素方差分析（Two－way ANOVA）檢驗(yàn)處理的顯著性；用LSD法進(jìn)行處理間多重比較；用Pearson相關(guān)分析法來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)顯著性。用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨與Cd復(fù)合脅迫對(duì)紫萼植株形態(tài)的影響

如圖1，單一酸雨下，pH≥4.5時(shí)紫萼葉片幾乎沒(méi)有傷害癥狀；pH在2.5～3.5時(shí)，葉片才出現(xiàn)受害癥狀，雖與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但受害面積都在5%以下，說(shuō)明紫萼是一種對(duì)酸雨抗性較強(qiáng)的植物。單一Cd處理下，濃度30mg／kg是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，開(kāi)始出現(xiàn)明顯的可見(jiàn)傷害，可見(jiàn)壞死百分比隨Cd濃度增加而增大，處理間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。通過(guò)對(duì)主效應(yīng)和交互作用進(jìn)行分析可知，酸雨與Cd交互作用顯著（P＜0.05），更多地表現(xiàn)為協(xié)同作用。這種傷害作用在酸雨pH≥4.5以及Cd濃度≤30mg／kg水平下并不明顯，在酸雨pH≤3.5以及Cd濃度≥30mg／kg水平下，這種傷害明顯大于兩因素各水平傷害的簡(jiǎn)單加和。Cd是本試驗(yàn)中造成葉片壞死的主要貢獻(xiàn)者，酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是對(duì)紫萼造成可見(jiàn)傷害的臨界值。

圖1 模擬酸雨與Cd復(fù)合污染對(duì)紫萼葉片的可見(jiàn)傷害以及對(duì)MDA含量的影響Fig.1 Combined effects of Cd and Simulated acid rain on the visible damage and the MDA content in leaves of H.ventricosa

2.2 酸雨與Cd復(fù)合污染對(duì)紫萼質(zhì)膜過(guò)氧化的影響

圖2 模擬酸雨與Cd復(fù)合污染對(duì)紫萼ROS產(chǎn)生量的影響Fig.2 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the ROS content in leaves of H.ventricosa

2.3 模擬酸雨與Cd復(fù)合污染對(duì)紫萼抗氧化酶活性的影響

總體來(lái)看，隨Cd和酸雨污染強(qiáng)度的增加，紫萼葉片中SOD和CAT活性變化趨勢(shì)明顯，都表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢(shì)（圖3）。單一酸雨下，隨pH的下降，SOD和CAT活性明顯增加，pH為3.5和2.5時(shí)處理差異顯著。單一Cd處理下，SOD和CAT活性隨Cd濃度的增加都呈單峰型曲線，CAT活性達(dá)到峰值的濃度為30mg／kg，低于SOD的50mg／kg，說(shuō)明CAT活性對(duì)Cd污染更為敏感。復(fù)合處理下，酸雨pH≤5.5時(shí)SOD活性在Cd濃度為30mg／kg處即達(dá)到最大值；在pH為6.5時(shí)，SOD活性在50mg／kg處達(dá)到最大值。酸雨和Cd兩因素間交互作用顯著，Cd是造成葉片紫萼葉片中SOD和CAT活性變化的主要因素。

圖3 模擬酸雨與Cd復(fù)合污染對(duì)紫萼SOD和CAT酶活性的影響Fig.3 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the SOD and CAT activity in leaves of H.ventricosa

3 討論

葉片可見(jiàn)傷害是逆境脅迫危害的最直觀證據(jù)。紫萼對(duì)酸雨有一定的耐受性，只有在強(qiáng)酸雨下才表現(xiàn)出較輕的可見(jiàn)傷害，這與 Chen等［13］對(duì)木荷（Schimasuperba）與楓香（Liquidambarformosana）的研究結(jié)果一致。在Cd的復(fù)合作用下，酸雨與Cd產(chǎn)生了協(xié)同作用，加重了對(duì)紫萼葉片的傷害，但Cd濃度較低時(shí)可見(jiàn)傷害仍不明顯。酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是對(duì)紫萼造成可見(jiàn)傷害的臨界值，生理指標(biāo)的這一臨界值會(huì)提前顯現(xiàn)，說(shuō)明生理指標(biāo)對(duì)復(fù)合污染指示更為靈敏。

植物細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)能量交換的界面，逆境脅迫對(duì)植物的傷害首先作用于質(zhì)膜，產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜有害的ROS。植物的受害程度與ROS積累密切相關(guān)，ROS過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致質(zhì)膜過(guò)氧化加?。?4］。隨污染強(qiáng)度的增大，O2－·產(chǎn)生速率、H2O2含量隨之顯著升高，與Cd濃度呈極顯著正相關(guān)，表明高強(qiáng)度復(fù)合污染加劇了紫萼體內(nèi)自由基的量態(tài)，使植物遭受到更嚴(yán)重的傷害。Cd能使光呼吸系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，還可誘導(dǎo)NADPH氧化酶活性提高，促進(jìn)NADPH氧化，致使ROS大量生成［15］。

ROS產(chǎn)生量的變化情況，與SOD和CAT活性變化密切相關(guān)。正常情況下，植物體內(nèi)有一套完整的ROS清除系統(tǒng)，抗氧化酶是其重要組成部分。在遭受外界逆境的脅迫時(shí)，抗氧化酶能將ROS的產(chǎn)生與清除維持在較低的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而防止逆境脅迫對(duì)植物造成的ROS傷害。SOD是植物體內(nèi)ROS防御系統(tǒng)的第一道防線，能催化超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)成為基態(tài)的分子氧和H2O2，并與CAT共同組成ROS防御酶系統(tǒng)［16］。如圖3，正常紫萼體內(nèi)SOD活性較穩(wěn)定，ROS的產(chǎn)生與SOD的清除維持在動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)。紫萼在遭受較弱酸雨與Cd復(fù)合污染時(shí)，隨著脅迫強(qiáng)度的增加，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS會(huì)誘導(dǎo)SOD活性上升，從而大大增加了SOD對(duì)ROS的歧化能力，有效地清除ROS并防止逆境脅迫傷害。而當(dāng)脅迫強(qiáng)度超過(guò)植物的耐受限度時(shí)，SOD活性便開(kāi)始下降，CAT可以將H2O2催化分解為H2O和O2，其活性變化對(duì)植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化平衡起著重要作用。圖3的CAT活性變化表明，當(dāng)脅迫強(qiáng)度較小時(shí)，CAT酶活性被激活，有效地清除了紫萼體內(nèi)ROS代謝產(chǎn)生的H2O2；而當(dāng)脅迫強(qiáng)度較大時(shí)，CAT活性嚴(yán)重受到抑制，并呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，最終導(dǎo)致H2O2的過(guò)量積累，對(duì)紫萼產(chǎn)生毒害作用。H2O2可以和過(guò)量的O2－·生成毒性更強(qiáng)的·OH，對(duì)植物造成更嚴(yán)重的傷害［17］。從SOD和CAT酶活性峰值出現(xiàn)位置來(lái)看，CAT對(duì)復(fù)合污染的敏感性明顯高于SOD。

當(dāng)植物體內(nèi)ROS含量過(guò)多而不能及時(shí)被ROS防御酶清除掉時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致ROS的逐漸積累，進(jìn)而引發(fā)一系列膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，最終表現(xiàn)為質(zhì)膜透性的變化［18］。MDA是一種高活性的脂質(zhì)過(guò)氧化最終分解產(chǎn)物，能交聯(lián)脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜受損［19］。如圖2，酸雨強(qiáng)度較大時(shí)，可以顯著地促進(jìn)膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA含量上升。Cd含量與MDA含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，這表明MDA含量可以很好地指示紫萼葉片細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。氧自由基參與膜脂脫脂作用，在強(qiáng)氧化劑H2O2的作用下，通過(guò)Habe－weiss反應(yīng)產(chǎn)生攻擊力更強(qiáng)的·OH，啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化，最終造成MDA含量增加［20］；或是因?yàn)镽OS破壞生物功能分子如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類，最終引起膜的過(guò)氧化作用，導(dǎo)致MDA含量增加［21］。試驗(yàn)中MDA含量的變化，可與O2－·產(chǎn)生速率、H2O2含量變化相互印證。

4 結(jié)論

1）酸雨和Cd復(fù)合污染比單一因素污染對(duì)紫萼造成的傷害大，二者間存在明顯的交互作用，并非簡(jiǎn)單的加和作用，更多地表現(xiàn)為協(xié)同作用，高強(qiáng)度復(fù)合污染對(duì)紫萼的影響更大。2）紫萼對(duì)酸雨和Cd脅迫有較強(qiáng)的耐受性。相比而言，重金屬Cd是復(fù)合污染下造成植物傷害的主要因素。3）酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是造成植物可見(jiàn)傷害的臨界值，且生理指標(biāo)比形態(tài)指標(biāo)更為敏感，CAT活性對(duì)Cd污染脅迫響應(yīng)比SOD敏感。

總之，無(wú)論是復(fù)合污染還是單一污染，紫萼都表現(xiàn)出較好的耐受性，出現(xiàn)一個(gè)明顯的耐受閾值。這為酸雨與Cd復(fù)合污染地區(qū)的植物生態(tài)修復(fù)提供了一些可供參考的依據(jù)。

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