基于高通量測序的海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組學研究

賈新平，葉曉青，梁麗建，鄧衍明，孫曉波，佘建明

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室，江蘇 南京210014）

海濱雀稗（Paspalumvaginatum，Seashore paspalum）是禾本科（Gramineae）黍族（Paniceae）雀稗屬（Paspalum）的多年生草本植物，原產(chǎn)于美洲，為潮間帶草灘植被的主要組分［1－2］。海濱雀稗是目前耐鹽能力最強的草坪草種，還具有較強的耐澇、耐旱、耐踐踏和耐磨損特性，能在復雜的逆境條件下生長［3－8］。海濱雀稗的葉色翠綠，景觀效果優(yōu)于狗牙根（Cynodondactylon）、結(jié)縷草（Zoysiajaponica）和假儉草（Eremochloaophiuroides）等暖季型禾草，作為草坪草在世界熱帶與亞熱帶地區(qū)廣為種植，已成為21世紀最具發(fā)展?jié)摿Φ牟萜翰莘N［9］。同時，海濱雀稗還具有良好的適口性和營養(yǎng)價值，可作為優(yōu)良牧草加以利用［10］。關(guān)于海濱雀稗的遺傳多樣性、分子標記輔助育種等研究已有報道［11－12］，但其基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的缺乏，造成海濱雀稗分子標記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、生長發(fā)育及其抗逆機理方面的研究相對滯后［13］。

近年來，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等各種組學技術(shù)在揭示細胞生理活動規(guī)律和生物代謝機理的研究中起著越來越重要的作用，而轉(zhuǎn)錄組學是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)［14］。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指細胞在特定狀態(tài)下全部表達的RNA的總和，反映相同基因在不同條件下表達水平的差異，并能揭示不同基因的相互作用及各自功能［15］。轉(zhuǎn)錄組測序能全面快速地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態(tài)下的基因表達情況，用于研究基因結(jié)構(gòu)和功能、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預測等［16－20］。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，轉(zhuǎn)錄組測序無需已知序列設(shè)計探針，可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍。對于許多缺乏基因組信息的物種而言，轉(zhuǎn)錄組研究已在非模式植物中得到了廣泛應(yīng)用［21－26］。

盡管海濱雀稗具有很高的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，但其分子生物學研究進展緩慢，基因數(shù)據(jù)庫資源也十分匱乏。隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，極大地促進了植物基因表達研究，這樣不僅可降低測序的成本和時間，而且還可以獲得豐富的數(shù)據(jù)，有利于植物生長發(fā)育及其抗逆等方面的研究［27］。到目前為止，利用新一代高通量測序技術(shù)進行草坪種質(zhì)資源創(chuàng)新與開發(fā)的研究還未見報道。本研究首次將Illumina HiSeq 2000高通量測序技術(shù)應(yīng)用到草坪草轉(zhuǎn)錄組研究中，將測序得到的海量數(shù)據(jù)進行拼接與組裝，結(jié)合生物信息學方法對所獲得的unigene進行基因功能注釋、功能分類、代謝途徑等分析，從功能基因組水平上研究海濱雀稗生長發(fā)育過程中重要基因的表達，同時也為進一步的分子標記開發(fā)和基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗材料為海濱雀稗品種“Adalayd”，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)所植物細胞工程課題組提供。試驗于2013年8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)所溫室中進行，選取長勢良好、健康的植株葉片，迅速將其放入紙帶內(nèi)，立即經(jīng)液氮速凍后保存于實驗室超低溫冰箱中備用。

1．2 RNA提取

利用TRIzoL法提取試驗材料海濱雀稗葉片的總RNA。將樣品放入研缽，加適量液氮迅速研磨，轉(zhuǎn)移到經(jīng)DEPC處理的2mL離心管中，加入1mL TRIzoL（Invitrogen，CarLsbad－CA92008，USA），旋渦振蕩混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移入新的1．5mL離心管，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，用力搖15s，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移至新的1．5mL離心管，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液，用RNase－free水配制的75%乙醇洗滌；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液；置于冰上自然干燥5min，用RNase－free水溶解，保存于－70℃?zhèn)溆谩Ｓ肁giLent 2100BioanaLyzer檢測RNA提取質(zhì)量，RIN值≥7．0。

1．3 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝

提取樣品總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。首先加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短序列，以這些短序列為模板，用六堿基隨機引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈。cDNA經(jīng)過試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、加poly（A）并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行序列大小選擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進行測序。采用Illumina兩個末端（PE）測序法，最初的原始序列為100bp。原始的測序結(jié)果去除制備文庫時產(chǎn)生的接頭序列、兩端低質(zhì)量序列和低度復雜序列，再利用SOAPdenovo軟件進行序列拼接［26］，之后通過連接兩末端和填補空位，將拼接成的重疊群（Contig），進一步組裝成unigene。轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的原始序列信息已提交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫（SRA BioProject：SRX383837）。

1．4 功能注釋、分類和代謝途徑分析

采用序列比對的方法對unigene進行序列相似性分析，使用BLAST程序?qū)⑵唇拥玫降膗nigene與核酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對（E值≤1×10－10），選取最佳的功能注釋。核酸數(shù)據(jù)庫為NCBI的非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫（non－redundant nucleotide database，Nt），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包括 NCBI的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫（non－redundant protein database，Nr）和SwissProt（swissprot protein sequence database）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫的功能注釋信息，使用Blast2GO軟件［27］得到unigene的GO條目，然后用WEGO軟件［28］對所有的unigene進行GO功能分類統(tǒng)計。然后對unigene分別進行蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫（cluster of orthologous groups，COG）功能分類和京東基因與基金組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝途徑分析。

1．5 SSR位點搜索及分析

對海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組中的unigene序列進行簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）位點搜索，搜索標準為：單、二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）至少重復次數(shù)分別為10，8，5，4，3，3，對查找的SSR類型進行特征分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

采用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術(shù)對海濱雀稗葉片轉(zhuǎn)錄組進行了測序，共得到47520544個reads片段，每個reads的長度為100bp，即測序獲得了4752054400bp（4．75Gb）的序列信息。采用SOAPdenovo軟件對reads序列聚類進行拼接，共獲得966165個contig序列。其中，長度50～100bp的contig序列有761498個，占總體的78．82%；100～200bp的contig序列有125173個，占總體的12．96%；而≥200bp的contig序列有79494個，占總體的8．22%（表1）。由此可見，contig序列主要以長度為50～100bp為主，完全符合Illumina測序的預期結(jié)果，為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供很好的原始數(shù)據(jù)。

在contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進一步對序列進行組裝，共獲得81220個unigene，序列信息達到了87542503bp（87．54Mb），序列大小為201～16328bp，平均長度為1077bp，N50為1680bp。其中，長度200～500bp的unigene有29325個，占總體的36．11%；500～1000bp的unigene有18341個，占總體的22．58%；≥1000bp的unigene有33554個，占總體的41．31%（表2）。

表1 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組contig數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計Table 1 Data assembly for contig in the transcriptome of P． vaginatum

表2 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組unigene數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計Table 2 Data assembly for unigene in the transcriptome of P． vaginatum

表3 海濱雀稗unigene的GC含量統(tǒng)計Table 3 Data assembly for GC content of P． vaginatumunigene

GC含量是基因組堿基序列的重要特征之一，能反映基因的結(jié)構(gòu)、功能和進化信息，GC分布不均勻?qū)е禄蚪M不同GC含量序列其性質(zhì)和功能也有差異。海濱雀稗unigene的GC平均含量為49．98%，其中GC含量40%～60%的unigene（59903個）占總體的73．75%，GC含量20%～40%的unigene（6552個）占總體的8．07%，GC含量60%～80%的unigene（14765個）占總體的18．18%，而GC含量過高（大于80%）或過低（小于20%）的unigene不存在，表明GC含量基本呈正態(tài)分布（表3）。

用RPKM方法計算unigene的表達水平，可消除基因長度差異和測序深度的影響［29］。海濱雀稗全部unigene的RPKM平均值為28．68，最大值為50812．5（unigene 42358）。281個unigene的RPKM 值大于500，其中許多基因參與到海濱雀稗的多種生理活動和代謝過程中。91個unigene的RPKM值低于0．2，說明Illumina HiSeq 2000能夠檢測到極低水平的基因表達。

2．2 unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2．2．1 unigene的序列相似性分析 使用BLAST程序?qū)⒔M裝得到的unigene與Nr、Nt、SwissProt數(shù)據(jù)庫進行比對，進行unigene的序列相似性分析。結(jié)果表明，38446個unigene在Nr數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有22629個（占總體的58．86%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15817個（占總體的41．14%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱（Sorghumbicolor）所占比例最高（45．76%），隨后依次是玉米（Zeamays，38．68%）、水稻（Oryzasativa，8．91%）、小麥（Triticumaestivum，2．45%）和其他物種（4．20%）（圖1）。46169個unigene在Nt數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有28599個（占總體的61．94%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有17570個（占總體的38．06%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱所占比例最高（62．72%），隨后依次是玉米（25．82%）、水稻（3．81%）、短柄草（Brachypodiumdistachyon，2．11%）和其他物種（5．54%）。24471個unigene在SwissProt數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有8742個（占總體的35．72%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15729個（占總體的64．28%）；相似序列匹配的近緣物種中，擬南芥（Arabidopsisthaliana）所占比例最高（46．03%），隨后依次是水稻（20．10%）、玉米（8．30%）、小麥（3．73%）和其他物種（21．84%）（圖1）。由于缺乏海濱雀稗的基因組、EST和蛋白序列信息，部分unigene在數(shù)據(jù)庫中無法匹配到已知基因。

圖1 海濱雀稗unigene的序列相似性分析Fig．1 Characteristics of homology search of P． vaginatumunigene

2．2．2 unigene的GO分類 基因本體論（gene ontology，GO）是一個國際標準化的基因功能分類數(shù)據(jù)庫，用于全面地描述不同生物中基因的生物學特征。結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫對海濱雀稗的unigene進行功能分類，從宏觀上認識海濱雀稗表達基因的功能分布特征。GO數(shù)據(jù)庫包括3個相對獨立的本體，分別描述所處的細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和參與的生物學過程（biological process）。研究結(jié)果表明，可將海濱雀稗unigene劃分為48個功能組，并對每個功能組涉及的unigene進行了統(tǒng)計分析。從圖2中可以看出，51497個unigene歸屬于細胞組分，22718個unigene歸屬于分子功能，60856個unigene歸屬于生物學過程，這一分類結(jié)果顯示了海濱雀稗生長過程中基因表達譜的總體情況。其中，“細胞成分”（18763個）、“細胞進程”（17347個）、“代謝進程”（13891個）和“結(jié)合活性”（10726個）功能組中涉及的unigene較多，而“翻譯調(diào)節(jié)活性”（7個）、“金屬伴侶蛋白活性”（4個）、“氮素利用”（2個）和“蛋白標簽”（2個）功能組中涉及的unigene較少。

2．2．3 unigene的COG功能分類 蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫（cluster of orthologous groups，COG）是對基因產(chǎn)物進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。將海濱雀稗unigene與COG數(shù)據(jù)庫進行比對，預測unigene功能并進行分類統(tǒng)計。研究結(jié)果表明，海濱雀稗unigene根據(jù)其功能大致可分為25類，并對每類的unigene進行了統(tǒng)計分析（圖3中用A～Z表示）。從圖中可以看出，unigene涉及的COG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動。其中，一般功能預測類基因最多（4716個）；其次是未知功能類基因（3306個）、翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生類基因（2662個）、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶類基因（2247個）和碳水化合物運輸和代謝類基因（2087個）；而胞外結(jié)構(gòu)類基因（11個）和核結(jié)構(gòu)類基因較少（7個）；其他類別的基因表達豐度都各不相同。

圖2 海濱雀稗unigene的GO分類Fig．2 GO functional categories of P． vaginatumunigene

圖3 海濱雀稗unigene的COG功能分類Fig．3 COG function classification of P． vaginatumunigene

2．2．4 unigene的 KEGG分析 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋信息能進一步得到unigene的pathway注釋［30］。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，對海濱雀稗的unigene可能參與或涉及的代謝途徑進行了統(tǒng)計分析。研究結(jié)果表明，可將海濱雀稗的unigene歸屬于五大類的代謝途徑，主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類物質(zhì)代謝、次生物質(zhì)代謝、復制與修復、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號轉(zhuǎn)導等19類代謝途徑（圖4）。將KEGG pathway數(shù)據(jù)庫作為參考，可將unigene定位到112個具體的代謝途徑分支。其中，涉及糖異生和糖酵解途徑的基因有140個，占總體的3．35%；磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)途徑的基因有133個，占總體的3．18%；甘油磷脂代謝途徑的基因有130個，占總體的3．11%；苯丙氨酸代謝途徑的基因有79個，占總體的1．89%；RNA降解途徑的基因有68個，占總體的1．63%；黃酮類化合物合成途徑的基因有44個，占總體的1．05%；植物與病原物互作的基因有23個，占總體的0．56%（表4）。

圖4 海濱雀稗unigene的KEGG分類Fig．4 KEGG classification of P． vaginatumunigene

2．3 SSR分析

對海濱雀稗的81220個unigene進行SSR位點搜索，共檢測到22721個SSR位點。SSR的類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型均存在，所占比例變化較大（表5）。其中，三核苷酸重復所占比例最高，達到了31．71%；比例最低的是二核苷酸重復，僅為4．35%；五核苷酸重復和六核苷酸重復所占比例基本相同，分別為14．15%和14．67%。在檢測到的SSR中，出現(xiàn)頻率最高的10類基序為：A／T（6198個）、CCG／CGG（2992個）、AGC／CTG（1277個）、AGG／CCT（1249個）、AG／CT（776個）、ACG／CGT（516個）、AAG／CTT（415個）、ACC／GGT（376個）、AGAGG／CCTCT（259個）、AGGG／CCCT（197個）。上述SSR特征分析，有助于開展海濱雀稗及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建的研究。

3 討論

隨著新一代高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，植物基因組研究得到快速發(fā)展，但草坪草基因組研究還相對較少。Illumina高通量測序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高［31］，適合于沒有基因組信息的海濱雀稗展開轉(zhuǎn)錄組測序研究?；谵D(zhuǎn)錄組學在功能基因組學研究中的重要價值，本研究應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組進行測序，研究其基因表達譜和挖掘生長發(fā)育過程中的重要表達基因。對海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組進行測序，獲得了

47520544個reads序列；對reads序列進行拼接，共獲得了966165個contig序列。在contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，序列組裝后得到了81220個unigene，長度大小從201～16328bp，平均長度為1077bp，N50值為1680bp（N50指從組裝最長的unigene依次向下求長度的總加和，當累加長度達到組裝長度的一半時，對應(yīng)的unigene長度是N50長度。N50值越大，反映組裝得到的長片段越多，組裝效果就越好。測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量和數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量是轉(zhuǎn)錄組測序完成情況的重要指標。以上研究結(jié)果表明，此次序列組裝的質(zhì)量和長度可以滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求，且新一代高通量測序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)海濱雀稗功能基因的更為有效手段，進一步說明Illumina HiSeq 2000是高通量轉(zhuǎn)錄組測序的可靠平臺。

表4 海濱雀稗unigene的代謝途徑分析Table 4 Analysis of metabolic pathways of P． vaginatumunigene

續(xù)表4 Continued

表5 海濱雀稗SSR不同重復基序分布及優(yōu)勢堿基組成Table 5 Distribution and compositions of the dominant repeat of the different repeat motifs for SSR

結(jié)合生物信息學分析方法，對海濱雀稗unigene與Nr、Nt、SwissProt數(shù)據(jù)庫進行比對，進行序列相似性和功能注釋分析。46169個unigene與其他近緣生物的已知基因具有不同程度的同源性，并且還獲得了35051個新的unigene（占總體的56．84%），表明在對海濱雀稗基因組及遺傳背景幾乎不清楚的情況下，高通量測序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)海濱雀稗功能基因的有效手段。雖然GO是個標準化的生物信息本體數(shù)據(jù)庫，被廣泛地用于基因的注釋功能，然而由于GO結(jié)構(gòu)設(shè)計上的缺陷以及基因的許多特征還未被發(fā)現(xiàn)，使得這種基因注釋信息尚不完全。因此，本研究中的海濱雀稗unigene基于GO數(shù)據(jù)庫進行的相關(guān)功能注釋信息還不完善，還有部分的unigene沒有賦予了可能的GO條目，有待通過其他生物信息學方法對unigene功能注釋進一步補充。利用COG數(shù)據(jù)庫對海濱雀稗unigene進行基因功能分類，可從基因組水平上找尋直系同源體，預測未知ORF的生物學功能，可以大大提高基因功能注釋的準確性。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對上述unigene進行代謝途徑分析，涉及112個具體的代謝途徑分支，參與到海濱雀稗體內(nèi)的碳水化合物代謝、脂類代謝、次生物質(zhì)代謝等過程中，為進一步大量挖掘海濱雀稗生長發(fā)育過程中的重要表達基因，開展海濱雀稗的基因克隆及功能驗證等研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

SSR分子標記具有操作簡便、重復性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大、共顯性遺傳等優(yōu)點，已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因發(fā)掘、分子標記輔助育種等研究中得到了廣泛應(yīng)用［32－36］。采取實驗室手段開發(fā)SSR引物費時，耗力，成本高，試驗復雜，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息進行SSR分子標記開發(fā)將是一種既經(jīng)濟又有效的方法。目前，海濱雀稗可利用的分子標記數(shù)量非常有限，轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)為SSR分子標記的開發(fā)提供了更豐富和極有價值的可利用資源。本研究通過查找發(fā)現(xiàn)了22721個SSR位點，SSR不但出現(xiàn)頻率高，而且類型豐富。利用在線引物設(shè)計軟件共設(shè)計出8758對SSR引物，進一步可對這些SSR引物進行擴增檢測，篩選出擴增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好的引物，為進一步開發(fā)新的SSR標記奠定了基礎(chǔ)。SSR分子標記的開發(fā)可用于草坪草功能基因的挖掘、豐富分子標記類型、遺傳資源評價、重要性狀的輔助選擇等研究，有助于促進草坪草遺傳育種的發(fā)展［37－38］。

本研究首次在國內(nèi)外采用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術(shù)建立了海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄本信息，并對表達基因進行了序列組裝、功能注釋、代謝途徑等分析，為今后更深入研究海濱雀稗功能基因組、基因克隆及抗逆機理研究提供了極大的方便，而且該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還可以作為今后海濱雀稗基因組的參考序列，為海濱雀稗的分子生物學研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)來源。

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