黃花蒿抗瘧相關(guān)成分及抗氧化活性對施肥方式的響應(yīng)

羅世瓊，石安東，袁玲，黃建國*

(1．西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716;2．貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001)

黃花蒿(Artemisia annua)為菊科一年生草本植物，具有清熱、解暑、退黃、截虐等功效，用于陰虛發(fā)熱，署邪發(fā)熱，瘧疾寒熱，骨蒸勞熱，溫邪傷陰，夜熱早涼，濕熱黃疸等［1］，已臨床應(yīng)用2000多年。黃花蒿的主要化學(xué)成分包括萜烯類、黃酮類、香豆素、苯丙酸類和揮發(fā)油等［2］。其中，屬萜烯類的青蒿素是目前世界上治療瘧疾的首選藥物 (世界衛(wèi)生組織推薦)［3］。青蒿酸是合成青蒿素的前體［4］，具有抗細(xì)菌和真菌等活性［5］;青蒿素脫掉1個(gè)氧原子形成去氧青蒿素，也具有抗瘧活性，但總體降低青蒿素的抗瘧藥效［6］。黃酮類不僅具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血壓、防止冠脈粥樣硬化、抗癌等作用，臨床上用于治療冠心病和高血壓［7］;而且還具有清除自由基，保護(hù)細(xì)胞，延緩衰老的功效，并與青蒿素起協(xié)同抗瘧和抗癌的作用［8-9］。因此，黃花蒿可用于人和動(dòng)物的疾病治療和保?。?，8］。有研究表明，以黃花蒿作為反芻動(dòng)物的飼料添加劑，不僅向動(dòng)物提供所需的纖維素、大量元素、微量元素、氨基酸及維生素等，而且還含有黃酮和抗氧化活性成分［8］，可預(yù)防和治療動(dòng)物的某些疾病，如肉雞柔嫩艾美耳球蟲病等［10］。

目前，有關(guān)施肥對黃花蒿生長和青蒿素含量的影響研究較多。適量施用氮肥促進(jìn)黃花蒿生長，提高生物產(chǎn)量［11］，增加肥料中的磷鉀比例提高青蒿素含量［12］。但是，在黃花蒿栽培過程中，施肥方式對抗瘧相關(guān)成分的影響及其與抗氧化活性的關(guān)系研究甚少，而黃花蒿體內(nèi)的抗瘧相關(guān)成分和抗氧化活性與其作用和藥效密切相關(guān)。為此，論文研究了在不同施肥條件下，黃花蒿的生長、青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、總黃酮的含量分布和抗氧化活性等，旨在為提高黃花蒿的品質(zhì)和科學(xué)施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試黃花蒿品種為渝青1號(渝品審鑒2009008)，青蒿素含量高達(dá)2%，大面積種植于重慶市武陵山區(qū)和三峽庫區(qū)，由重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定并提供種子。

供試土壤采自重慶北碚典型、具有代表性黃砂壤，pH 6．5，有機(jī)質(zhì) 18．76 g/kg，全氮 0．77 g/kg，全磷 0．65 g/kg，全鉀 13．37 g/kg，堿解氮 39．92 mg/kg，有效磷 9．81 mg/kg，速效鉀 240．01 mg/kg。采取土壤后風(fēng)干，揀去根系和石礫等雜物，過0．5 cm篩備用。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2011年在西南大學(xué)農(nóng)場網(wǎng)室中進(jìn)行。采用直徑×高=30 cm×40 cm的聚乙烯塑料盆，每盆裝風(fēng)干土15．0 kg。適時(shí)播種，幼苗株高20 cm左右移栽(5月5日)，每盆1株。設(shè)置4種施肥處理:不施肥 (CK);無機(jī)肥(CF);有機(jī)肥(M);有機(jī)無機(jī)配施 (CFM)。每處理重復(fù)9次，共36盆。參考大田生產(chǎn)實(shí)際［12］，每盆均施用2．22 g純氮，N∶P2O5∶K2O=1∶1∶1，分別由腐熟干基豬糞、尿素、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4提供。其中豬糞氮、磷和鉀含量分別為24．99，6．57，16．85 g/kg。CFM處理以氮素用量的50%折算，即每盆施有機(jī)肥49．59 g，M處理每盆施有機(jī)肥99．17 g，CFM和M處理不足的 N、P、K用 CO(NH2)2、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4補(bǔ)充。在施肥時(shí)，磷、鉀肥和有機(jī)肥全做基肥，2/3氮肥做基肥，肥土混勻，另1/3氮肥移栽后30 d追施。

1．3 樣品采集

在黃花蒿現(xiàn)蕾期分別采集根、莖、葉植株樣品，105℃殺青，室內(nèi)自然陰干，稱重，取少量樣品經(jīng)70℃烘干測水分系數(shù)，干重乘以水分系數(shù)為生物量(產(chǎn)量)，其余樣品經(jīng)粉碎過0．42 mm篩，備測有關(guān)項(xiàng)目。

1．4 抗瘧相關(guān)成分的提取

抗瘧成分提取參照J(rèn)essing等［13］的方法，略有改動(dòng)，精密稱取250 mg樣品粉末，置100 mL磨口帶塞三角瓶中，加入25 mL無水乙醇，稱重，在25℃下，避光，培養(yǎng)箱中振蕩，121 r/min振蕩20 h，無水乙醇補(bǔ)足損失重量，過濾，將濾液密封于 －18℃保存，備測 1．5．2、1．5．3 和1．5．4 項(xiàng)。

1．5 測定項(xiàng)目與方法

1．5．1 土壤與肥料基本化學(xué)性質(zhì)測定 土壤、肥料基本理化性質(zhì)的測定按常規(guī)分析方法［14-15］。土壤有機(jī)質(zhì)采用濃硫酸(H2SO4)重鉻酸鉀(K4CrO4)氧化法;全氮采用凱氏定氮法;全磷采用 NaOH熔融鉬銻抗比色法;全鉀采用NaOH熔融火焰光度法;速效磷采用0．03 mol/L NH4F和0．025 mol/L HCl聯(lián)合浸提鉬藍(lán)比色法;堿解氮采用1 mol/L NaOH堿解擴(kuò)散法;土壤速效鉀采用1 mol/L乙酸銨(NH4OAc)浸提火焰光度法測定。

1．5．2 青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的分析 參照文獻(xiàn)［16］，用 GC－MS分析青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量。分析條件，色譜柱:DB-5 MS(30 m×0．25 mm×0．25μm);升溫程序:50～220℃ (15℃/min，保持5 min);220～230℃ (15℃ /min，保持10 min)，載氣:氦氣 (恒流，31．4 cm/s);分流比:10∶1;檢測器溫度:250℃;離子源溫度:250℃，標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的累積量等于青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量乘以生物量(干物重)。

1．5．3 總黃酮測定 根據(jù) NaNO2-Al(NO3)3-NaOH與黃酮形成絡(luò)合物的原理，用 Sigma公司提供的蘆丁作對照，在510 nm比色測總黃酮含量［1］。將總黃酮的含量乘以黃花蒿干物重為總黃酮的累積量。

1．5．4 抗氧化活性測定 根據(jù)抗氧化活性成分能清除 1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-dipheny-l，2-picrylhyrazyl，DPPH)的原理，參照文獻(xiàn)測定黃花蒿抗氧化活性［17-18］，用無水乙醇作試劑配制36．4μg/mL的DPPH溶液。在517 nm處分別測定其吸光值。按如下公式計(jì)算清除率:清除率(%)={［1－(Ai－Aj)］/A0}×100(Aj是為了消除浸提液顏色的干擾)。式中，Ai為1 mL供試樣品與4 mLDPPH溶液的吸光度;A0為4mL DPPH溶液和1 mL 80%乙醇的吸光度;Aj為1 mL供試樣品與4 mL 80%乙醇的吸光度。

1．6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007(12．0)軟件和SPSS 10．0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表中的數(shù)據(jù)均為9次重復(fù)的平均值，采用單因子方差分析(ANOVA)和LSD法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2．1 施肥方式對生物量的影響

圖1 施肥對黃花蒿生長的影響Fig．1 Effects of fertilization on biomass of A．a(chǎn)nnua

圖1可見，施肥顯著促進(jìn)黃花蒿生長，提高生物量，與以往的研究結(jié)果一致［11-12，19-20］。在施用CF、M和CFM的處理中，單株總生物量分別比不施肥增加了57．4%，91．6%和 92．3%。此外，在各處理之間，根系生物量差異不顯著，CFM和M的莖葉生物量顯著高于CF，說明施用有機(jī)肥的效果優(yōu)于化肥。因此，在黃花蒿種植實(shí)踐中，提倡施用有機(jī)肥對于促進(jìn)生長很必要。

2．2 抗瘧相關(guān)成分含量及累積量對施肥方式的響應(yīng)

表1是青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素和總黃酮在黃花蒿根、莖、葉中的含量和積累量。

青蒿酸:青蒿酸的含量分布因器官不同而異，葉片最高，其含量和累積量平均分別為 7733．60 mg/kg和 236．67 mg/株;莖其次，分別是 162．88 mg/kg 和 8．76 mg/株;根系最低，僅 79．33 mg/kg 和 1．26 mg/株，說明葉片是青蒿酸合成和儲存的主要器官。

施肥顯著提高青蒿酸的含量。施肥后，葉片中的青蒿酸含量增加1．21～2．25倍，CFM和M處理顯著高于CK;莖中的增加1．10～2．65倍，增幅表現(xiàn)出CFM＞CF＞M的趨勢;根系中的增加1．35～2．85倍，增加趨勢與莖相同。

表1 施肥方式對黃花蒿各器官抗瘧成分含量和積累量的影響Table 1 Influence of fertilization on concentration and accumulation of antimalarial com ponents in different organs of A．a(chǎn)nnua

不施肥處理青蒿酸的累積量最低，施肥使整株青蒿酸累積量增加2．48～5．94倍。其中，葉片增加2．40～5．71倍;莖增加1．85～5．64倍;根系中的增加1．73～3．13倍;青蒿酸的增幅均以CFM處理最為顯著。說明施肥尤其是CFM有利于提高青蒿酸的產(chǎn)量。

去氧青蒿素:在黃花蒿各器官中，去氧青蒿素含量和累積量均為葉片最高，平均值分別是456．98 mg/kg和13．38 mg/株;莖次之，為19．84 mg/kg 和 1．02 mg/株;根系最低，僅為5．07 mg/kg 和0．08 mg/株。由此可見去氧青蒿素主要分配于葉片。

施肥對去氧青蒿素含量的影響因器官不同而異，施肥總體上提高了各器官中的去氧青蒿素含量。與不施肥處理相比，葉片中去氧青蒿素含量提高 1．38～1．25倍;莖中的提高 2．90～3．75倍，根系中的提高 3．58～4．95倍;在CFM和M處理中，葉片和根系中去氧青蒿素含量均顯著高于CF。說明施用有機(jī)肥有利于提高去氧青蒿素含量。

施肥促進(jìn)去氧青蒿素累積，整株累積量增加 2．48～4．02倍，其中葉片增加 2．35～3．96倍，莖增加 5．22～7．5倍，根系中增加4．53～5．57倍。整株和葉片中的去氧青蒿素累積量M＞CFM＞CF;根莖中的去氧青蒿素累積量以CFM處理最高。說明施用有機(jī)肥有利于提高去氧青蒿素的產(chǎn)量。

青蒿素:在黃花蒿各器官中，青蒿素含量和累積量均以葉片最高，平均值分別為13424．39 mg/kg和394．83 mg/株;莖次之，為 507．00 mg/kg 和 27．24 mg/株;根系最低，僅 77．53 mg/kg 和 1．24 mg/株。說明葉片是青蒿素主要合成和儲存器官。

不施肥處理的青蒿素含量最低，施肥后顯著提高青蒿素含量，其中葉片中的青蒿素含量提高1．18～1．39倍，莖中提高2．81～3．06倍;根系中增加1．00～2．02倍。各器官的青蒿素含量表現(xiàn)出CFM＞M＞CF的趨勢，其中CFM和M差異不顯著，但均顯著高于CF。說明CFM和M有利于提高黃花蒿的青蒿素含量。

青蒿素累積量因器官不同而異，不施肥最低，施肥后顯著提高，整個(gè)植株的增幅為2．43～4．01倍，其中葉片為 2．35 ～3．95倍;莖4．27 ～6．15倍;根系1．28 ～2．57 倍。各器官的青蒿素含量表現(xiàn)出M ＞CFM ＞CF，其中CFM和M差異不顯著，但顯著高于CF。說明施肥尤其是施用有機(jī)肥顯著提高青蒿素產(chǎn)量。

總黃酮:黃花蒿不同器官的總黃酮含量也不一樣。其中，葉片最高，根系次之，莖最低，葉片中的總黃酮含量是根莖的3．64～5．25倍，類似青蒿素。說明黃花蒿葉片是積累或合成黃酮的主要器官。因此，在提取黃花蒿葉片青蒿素的同時(shí)也可提取黃酮。

圖2 施肥對黃花蒿抗氧化活性的影響Fig．2 Antioxidant activities of A．a(chǎn)nnua under different fertilization

施肥對總黃酮含量的影響因器官不同而異。施肥總體上對葉片總黃酮含量無顯著影響，但顯著提高莖中的總黃酮含量，根系總黃酮含量則降低。

施肥顯著提高黃花蒿總黃酮積累量，尤以CFM處理最為顯著，單株總黃酮積累量分別比不施肥(對照)提高了 72．48%(CFM)、66．90%(M)和54．65%(CF)。因此，黃花蒿種植過程中，施用有機(jī)肥及有機(jī)無機(jī)配施可提高總黃酮的產(chǎn)量。

2．3 抗氧化活性對施肥方式的響應(yīng)

圖2可見，在黃花蒿體內(nèi)，各器官的乙醇提取液對DPPH·清除率表現(xiàn)為:葉片＞根系＞莖，平均值依次為65．05%，45．15%和40．08%。說明黃花蒿葉片的抗氧化能力最強(qiáng)，顯著高于根系和莖，但后二者之間差異不顯著。此外，在不施肥的處理中，各器官乙醇提取液對DPPH·清除率最高，施肥后不同程度降低，類似施肥對菊花抗氧化活性成分的影響［21］。在施肥處理中，葉片的抗氧化活性在CFM顯著高于CF和M，后二者的差異不顯著。

2．4 黃花蒿抗瘧相關(guān)成分及抗氧化活性的相關(guān)性

相關(guān)分析表明，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量之間分別呈極顯著正相關(guān) (P＜0．01)，但這3種成分與總黃酮及DPPH·清除率無顯著相關(guān)(表2)。在黃花蒿體內(nèi)，總黃酮含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，可用回歸方程 y=9．2096x+35．447(r=0．4924*，n=36)表示二者的關(guān)系，其中y為DPPH·清除率，x為總黃酮含量(表2、圖3)。

表2 抗瘧相關(guān)成分及抗氧化活性的相關(guān)性分析(n=36)Table 2 Correlation between antimalarial compounds and antioxidants in A．a(chǎn)nnua(n=36)

圖3 黃花蒿總黃酮與抗氧化活性的回歸分析(n=108)Fig．3 Regression analyses of total flavonoids and antioxidant in A．a(chǎn)nnua(n=108)

3 討論

采集不同海拔的黃花蒿葉片，用GC－MS均能同時(shí)檢測到青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素3種抗瘧相關(guān)成分［16］。論文進(jìn)一步研究了上述成分、總黃酮和抗氧化活性在植株體內(nèi)的含量分布，以及施肥對它們的影響。結(jié)果表明，在葉片中的青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、總黃酮含量和抗氧化活性最高，莖次之，根系最低。說明葉片是合成和儲存上述成分的主要器官，是藥用重要部位。

施肥促進(jìn)黃花蒿的生長，單株生物產(chǎn)量比不施肥顯著增加。在施肥處理中。CFM和M處理的生物量顯著高于 CF，類似前人研究結(jié)果［11-12，19-20］。同時(shí)，施肥顯著提高青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量和產(chǎn)量，盡管施肥總體上對葉片總黃酮含量無顯著影響，根系總黃酮含量降低，但顯著提高黃花蒿生物量，故黃花蒿總黃酮產(chǎn)量仍然顯著增加。需要指出的是，CFM和M處理的抗瘧成分產(chǎn)量顯著高于CF。因此，在人工種植黃花蒿的過程中，施用有機(jī)肥可提高抗瘧成分產(chǎn)量。此外，相對于其他抗瘧成分，黃花蒿的莖含有較高的黃酮，僅次于葉，變化于590．57～814．24 mg/kg之間。目前，對黃花蒿莖的利用較少，往往丟棄在田間地頭［22］，建議將其粉碎加入反芻動(dòng)物的飼料中，有益于動(dòng)物健康，減少抗生素使用［8］。

在不施肥的處理中，總黃酮含量及DPPH·清除率最高(莖的總黃酮含量除外)，施肥后不同程度降低。其原因可能是在缺肥條件下，黃花蒿產(chǎn)生了一系列應(yīng)急反應(yīng)，根系釋放出大量的含有酚羥基的黃酮類，活化土壤中的礦質(zhì)養(yǎng)分，如P，K，F(xiàn)e等，提高它們的生物有效性［23］。另一方面，有些黃酮成分具有抗菌和殺蟲作用，有利于提高黃花蒿植株自身免疫力［24］。

統(tǒng)計(jì)分析表明，在黃花蒿植株體內(nèi)，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素之間分別呈極顯著正相關(guān) (P＜0．01)，相關(guān)系數(shù)分別為0．972＊＊，0．959＊＊和0．998＊＊(n=36)。其原因可解釋為它們有共同的生源途徑，青蒿酸是青蒿素的合成前體［4］，去氧青蒿素是青蒿素的代謝產(chǎn)物［6］。但是，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素與DPPH·清除率無顯著相關(guān)，說明這些抗瘧成分沒有清除DPPH·的作用。在黃花蒿體內(nèi)，總黃酮含量與DPPH·清除率呈顯著正相關(guān)，類似菊花體內(nèi)總黃酮含量與抗氧化活性的關(guān)系［21］，說明黃花蒿的總黃酮具有抗氧化活性。黃花蒿含有40多種黃酮類物質(zhì)，如貓野草酚、貓野草黃素、紫花牡丹素及蒿黃素等。在它們的分子結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)芳香環(huán)上有羥基，由于共軛作用，羥基的電子向芳香環(huán)偏轉(zhuǎn)，使之具有較低的氧化還原電位，容易接受電子清除O2－·，產(chǎn)生抗氧化作用，故總黃酮含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)［7-8］。

4 結(jié)論

在黃花蒿體內(nèi)，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素及總黃酮等抗瘧成分在葉片中的含量最高，說明葉片是合成和儲存這些抗瘧成分的主要器官。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素之間分別呈極顯著正相關(guān)，總黃酮與DPPH·清除率呈顯著正相關(guān)。

施肥促進(jìn)黃花蒿生長，提高青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素等抗瘧成分的含量，但總體上對黃酮含量的影響不大，抗氧化活性則有所降低。

施肥顯著提高黃花蒿青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的產(chǎn)量，尤以有機(jī)無機(jī)配施和施用有機(jī)肥最為顯著。因此，在集約化種植黃花蒿的過程中，提倡施用有機(jī)肥很有必要。

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