馬鈴薯和擬南芥GAPC酶基因的克隆及分析

鄒雪，張燁，吳明陽，王西瑤

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都611130)

3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是生物中普遍存在的酶。在高等植物中，根據(jù)其存在位置、催化的反應(yīng)可分為3類:1)磷酸化NAD依賴型和非磷酸化NADP依賴型，由4個(gè)相同GapC亞基組成，存在于胞質(zhì)中參與糖酵解，前者催化的反應(yīng)產(chǎn)生含高能磷酸鍵的產(chǎn)物并在下一步反應(yīng)中生成3-磷酸甘油酸和ATP，后者催化反應(yīng)直接形成3-磷酸甘油酸，沒有ATP的產(chǎn)生;2)磷酸化NAD依賴型，存在于質(zhì)體中;3)磷酸化NADPH依賴型，由GapA和GapB兩種亞基組成，存在于葉綠體中，參與卡爾文循環(huán)［1-2］。由于糖酵解和卡爾文循環(huán)都是植物細(xì)胞能量代謝的主要途徑，因此GAPDH在植物碳代謝和能量代謝中起關(guān)鍵作用。Brinkmann等［3］、Russell和 Sachs［4］最初從玉米(Zea mays)中克隆到 3個(gè)胞質(zhì)三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPC)［3-4］，迄今已從多種植物中克隆到該基因，如擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、西伯利亞蓼(Polygonum sibiricum)［5-7］。最初人們認(rèn)為GAPC蛋白僅參與糖酵解其mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，因此將GAPC作為RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等檢測(cè)中的內(nèi)參基因，但近年來越來越多的研究表明植物GAPC對(duì)鹽、干旱、高滲、低溫、高溫、活性氧、低磷、病菌侵染等多種逆境脅迫均有響應(yīng)，并通過過量表達(dá)GAPC基因獲得了抗鹽脅迫的水稻和馬鈴薯(Solanum tuberosum)［8-14］。

磷對(duì)重要糧食作物馬鈴薯的塊莖形成以及淀粉積累都有良好的促進(jìn)作用，并交叉影響抗逆表現(xiàn)，而我國(guó)農(nóng)田有2/3缺磷，因此研究馬鈴薯的磷吸收利用機(jī)制并通過生物技術(shù)增強(qiáng)馬鈴薯對(duì)磷的吸收和利用效率具有重要意義［15-18］。王西瑤等［10，19］從擬南芥耐低磷突變體中首先鑒定到At GAPC2蛋白與耐低磷性狀相關(guān)，進(jìn)一步分析表明低磷誘導(dǎo)該基因(AtGAPC2)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，T-DNA插入突變體表現(xiàn)出對(duì)低磷脅迫的敏感性。Penaloza等［9］研究發(fā)現(xiàn)白羽扇豆(Lupinus albus)在低磷脅迫的早期及晚期與NAD-依賴型GAPDH同源的基因表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)糖酵解在白羽扇豆響應(yīng)低磷脅迫的特殊機(jī)制中起作用。但 Hajirezaei等［20］通過反義技術(shù)沉默馬鈴薯 GAPC基因(StGAPC)，表明該基因在馬鈴薯塊莖形成的代謝調(diào)節(jié)上僅發(fā)揮次要作用。

StGAPC和AtGAPC2所編碼的蛋白在功能多樣性上是否具有差異，GAPC的過量表達(dá)能否提高馬鈴薯對(duì)低磷、鹽等多種逆境脅迫的抗性，為此本實(shí)驗(yàn)分別克隆了這2個(gè)基因并對(duì)兩者的序列和蛋白結(jié)構(gòu)作對(duì)比分析;同時(shí)利用多種植物的GAPC序列建立進(jìn)化樹，分析環(huán)境脅迫對(duì)GAPC進(jìn)化及功能多樣性產(chǎn)生的影響;最后分別構(gòu)建了這2個(gè)基因的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步驗(yàn)證GAPC的功能多樣性并獲得耐逆境脅迫的馬鈴薯材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥種子(Columbia生態(tài)型)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所張素芝教授提供。馬鈴薯栽培型品種米拉，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究開發(fā)中心提供。植物表達(dá)載體pBI121由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李立芹副教授惠贈(zèng)，克隆載體pMDTM19-T Simple Vector(TaKaRa)購自寶生物公司。

1．2 方法

1．2．1 AtGAPC2和StGAPC基因的克隆 實(shí)驗(yàn)于2010年10－12月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究開發(fā)中心完成，分別取擬南芥和馬鈴薯幼苗葉片100 mg，采用Trizol法提取總RNA，以40μL DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理水溶解。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，體系為20μL，在用DEPC處理過的無菌0．2 mL PCR管中依次加入:oligo dT 1μL，RNA 3μL，DEPC處理水8μL，輕微混勻并離心30 s，65℃變性5 min，冰上急冷2min，按序加入5×Reaction Buffer 4 μL，RNase抑制劑 (20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTPMix 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 (200 U/μL)1μL。輕微混勻稍離心，42℃，60 min，72℃ 10 min終止反應(yīng)。以第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，根據(jù)NCBI上公布的AtGAPC2(擬南芥)和StGAPC(馬鈴薯)的CDS全長(zhǎng)序列(Accession No．AY090275，AF527779)，用Oligo 6軟件分別設(shè)計(jì)引物并引入XbaⅠ、SmaⅠ酶切位點(diǎn)。

AtGAPC2 P1:5'TCTAGAATGGCTGACAAGAAGATCAGAAT3'，P2:5'CCCGGGTTAGGCCTTTGACATGTGAACG3'。

StGAPC P1:5'TCTAGAATGGCCAATGGCAAGATCAAAAT3'，P2:5'CCCGGGTCAAGCCTTGGCCATAT3'。

PCR 擴(kuò)增體系為25 μL，反應(yīng)體系中加入:ddH2O 16 μL，10×PCR buffer 2．5 μL，P1(10 μmol/L)0．5 μL，P2(10 μmol/L)0．5 μL，dNTPMixture(2．5 mmol/L)2．0 μL，cDNA，1．0 μL(擬南芥或馬鈴薯)，TaKaRa Ex Taq 0．5 μL，MgCl22．0 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件，擬南芥:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延長(zhǎng)60 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 延長(zhǎng)10 min。馬鈴薯:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，68℃退火延長(zhǎng)90 s，30個(gè)循環(huán);68℃ 延長(zhǎng)10 min。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1．2．2 基因克隆及測(cè)序 電泳檢測(cè)后回收純化目的片段，與克隆載體pMDTM19-T Simple Vector在4℃連接24 h，10 μL 連接體系如下:pMD19-T Vector 0．5 μL，Insert DNA 3．5 μL，Solution I 5 μL，ddH2O 1 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在涂有X-gal(20 mg/mL)40μL和IPTG(200 mg/mL)4μL的含Amp(100μg/mL)的LB平板上作藍(lán)白斑篩選。將篩選的白色單克隆提質(zhì)粒作PCR檢測(cè)和質(zhì)粒酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系20μL:XbaⅠ和 SmaⅠ0．5/0．5 μL，0．1%BSA 0．2 μL，10 ×T Buffer2．0 μL，ddH2O 1．8 μL，質(zhì)粒15．0 μL。30℃水浴6 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。最后各隨機(jī)選取3個(gè)克隆，3次重復(fù)測(cè)序(上海生工生物工程股份有限公司)。

1．2．3 序列分析與比較 將測(cè)得的序列拼接后通過NCBI的BLAST尋找核苷酸同源序列(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)。利用ProtParam程序預(yù)測(cè)氨基酸序列分子量和理論等電點(diǎn)(pI)、不穩(wěn)定系數(shù)等，用ProScale程序預(yù)測(cè)蛋白疏水性，通過Conserved Domains程序進(jìn)行保守功能區(qū)分析(http://au．expasy．org/)。將氨基酸序列提交Swiss-Model預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)，用Rasmol 2．6查看圖像。用Clustal X和DNAMAN對(duì)克隆的兩種基因作核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，并將NCBI中不同植物的GAPC序列數(shù)據(jù)作進(jìn)化樹分析。

1．2．4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用內(nèi)切酶Xba I和Sma I對(duì)表達(dá)載體pBI121和克隆載體pMD-AtGAPC2、pMDStGAPC 進(jìn)行酶切，酶切體系50 μL:10 ×T Buffer 5．0 μL，0．1%BSA 5．0 μL，Xba I和 Sma I 1．0 μL，質(zhì)粒30．0 μL，ddH2O 8．0μL，30℃進(jìn)行4～6 h。電泳后切膠回收相應(yīng)片段連接，連接體系20．0μL:T4 DNA連接酶(3 U/μL)2．0 μL，10 ×Buffer 2．0 μL，pBI121 Vector 4．0 μL，目的片段 12．0 μL，4℃24 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在含卡那霉素(Kan，50μg/mL)的平板上篩選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒PCR、酶切鑒定后將正確的重組質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)中，在含Kan+(50μg/mL)和利福平(25μg/mL)YEB平板上挑選單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)后提質(zhì)粒作PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2．1 AtGAPC2和StGAPC基因的克隆

從野生型擬南芥Col和栽培型馬鈴薯品種米拉中分別提取RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，如圖1A所示，有28S，18S以及5S三個(gè)條帶，說明RNA的完整性較好。由Oligod(T)作引物轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此為模板，根據(jù)Genbank公布的序列設(shè)計(jì)引物，用高保真DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq擴(kuò)增目的條帶，取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，表明得到了預(yù)期大小的片段(約1000 bp，圖1B)?；厥漳康钠?，與克隆載體pMDTM19-T Simple Vector連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選白斑進(jìn)行滯后質(zhì)粒篩選(圖2A)，進(jìn)行PCR及XbaⅠ、SmaⅠ雙酶切檢測(cè)(圖2B、圖2C)。檢測(cè)結(jié)果表明無論是擴(kuò)增還是酶切均能獲得1000 bp左右片段。

圖1 總RNA提取及RT－PCR擴(kuò)增GAPC基因Fig．1 Total RNA extraction and GAPC gene am plification

圖2 含目的基因的克隆檢測(cè)Fig．2 Identification of clones

挑選重組子pMD-AtGAPC2和pMD-StGAPC各3個(gè)，每個(gè)3次重復(fù)作測(cè)序，其中pMD-AtGAPC2有2個(gè)重組子的序列與公布序列完全一致，另有1個(gè)發(fā)生A到G的變異。而pMD-StGAPC的3個(gè)重組子與公布序列均有差異:其中1個(gè)在404 bp處由T變?yōu)镃;1個(gè)在143 bp處由T變?yōu)镃，且871 bp處由G變?yōu)锳;第3個(gè)在976 bp處由T變?yōu)锳，由于3個(gè)重組子與公布序列的差異在不同位置，所以很可能是PCR擴(kuò)增時(shí)堿基錯(cuò)配造成，另選3個(gè)pMD-StGAPC重組子測(cè)序，其中2個(gè)與公布序列完全一致，另1個(gè)在158 bp處C變?yōu)門，601處A變?yōu)镚。將所獲得的測(cè)序正確克隆擴(kuò)繁后再作測(cè)序，仍與公布的序列完全相同，至此獲得了與公布序列完全一致的AtGAPC2和StGAPC基因的克隆。

2．2 StGAPC和AtGAPC2序列分析

2．2．1 StGAPC和AtGAPC2氨基酸序列分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 測(cè)序結(jié)果表明，兩者的開放閱讀框均為1017 bp，編碼338個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。兩者的比對(duì)表明核苷酸序列相似性為84%，氨基酸序列相似性達(dá)到92%。St GAPC氨基酸序列分子量為36．646 kDa，理論p I值6．34，整個(gè)氨基酸組成中纈氨酸(Val)含量最高達(dá)10．4%，其次是丙氨酸(Ala)占9．8%，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為20．21，屬穩(wěn)定蛋白;At GAPC2氨基酸序列分子量為36．913 kDa，理論p I值6．67，整個(gè)氨基酸組成中纈氨酸(Val)含量最高達(dá)11．5%，其次是賴氨酸(Lys)占9．2%，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為22．6，屬穩(wěn)定蛋白。以上可以看出兩者的基本性質(zhì)相似。從圖3A可以看出兩者在氨基酸序列上共有26處存在差異，有些是同類氨基酸間的轉(zhuǎn)變?nèi)?K-R、A-V、S-T、D-E，有些則是非極性與極性間的轉(zhuǎn)變?nèi)?G-K、A-P、MT、A-E。

圖3 St GAPC和At GAPC2氨基酸序列與單體三維結(jié)構(gòu)比較Fig．3 A ligment of am ino acid sequence and monomer 3D structure of St GAPC and At GAPC2

利用NCBI網(wǎng)站的Conserved Domains程序作保守功能區(qū)分析表明St GAPC和At GAPC2具有GAPDH典型的2個(gè)保守區(qū)域:NADB_Rossmann(登錄號(hào)cl09931)，即N端NAD(P)結(jié)合域;Gp_dh_C(登錄號(hào)pfam02800)，即C端行使糖結(jié)合功能和催化功能的區(qū)域。兩者均含所有GAPDH催化活性位點(diǎn)固有的特征序列ASCTTNCL(兩多肽鏈上的154～161位)(圖3A中下劃線所示)。

2．2．2 St GAPC和At GAPC2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Swiss-Model在線分析功能預(yù)測(cè)St GAPC和At GAPC2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，兩者均與模板3e5rC(Oryza sativa GAPDH C chain)的相似度最高，分別為85．629%和85．586%，并得到了St GAPC和At GAPC2蛋白單體的3D預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)(如圖3B所示)，三者的3D結(jié)構(gòu)非常相似，其中左邊區(qū)域有一個(gè)由7個(gè)β折疊構(gòu)成的馬鞍型超二級(jí)結(jié)構(gòu)位于催化結(jié)構(gòu)域中，起著固定活性中心的作用，而右邊區(qū)域的βαβαβ結(jié)構(gòu)形成Rossmann卷曲為結(jié)合NAD的區(qū)域。St GAPC蛋白單體包含16個(gè)α螺旋，22個(gè)β折疊，36個(gè)轉(zhuǎn)角;At GAPC2蛋白單體包含16個(gè)螺旋，22個(gè)β折疊，37個(gè)轉(zhuǎn)角;而3e5rC有15個(gè)α螺旋，20個(gè)β折疊，40個(gè)轉(zhuǎn)角。圖3B中1號(hào)和2號(hào)箭頭分別表示這兩種蛋白都有而3e5rC沒有的2個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋，3號(hào)箭頭顯示出兩者在參與形成該螺旋的氨基酸數(shù)目上有差異，而三者在N末端和C末端均有差異。

2．2．3 GAPC基因序列的同源性比較 將不同科、屬植物GAPC的核苷酸序列(CDS)以及氨基酸序列用DNAMAN作同源比對(duì)。結(jié)果顯示與馬鈴薯同科的植物中，普通蕃茄(Lycopersicon esculentum)核苷酸序列同源性與其最高為96．3%，其次是大葉煙草×花煙草(N．langsdorffii×N．sanderae)90．8%，野生型馬鈴薯(Solanum chacoense)和普通煙草(Nicotiana tabacum)與之同源性較低為80%左右;而氨基酸序列間的同源性高于核苷酸依次為98．6%，94．4%，89．3%，91．5%。AtGAPC2 與 AtGAPC1 以及同科的芥菜(Brassica juncea)、油菜(B．napus GAPC1和GAPC2)、白菜(B．rapa)等核苷酸序列同源性均為90%左右，而氨基酸同源性則高達(dá)98% ～96%。StGAPC和AtGAPC2都與禾本科植物，如玉米、水稻、小麥(Triticum aestivum)等的同源性較低，核苷酸為76% ～78%，氨基酸為85% ～87%。

根據(jù)多種植物GAPC基因的CDS序列建立如圖4所示進(jìn)化樹，蕨類植物復(fù)活卷柏與其他被子植物處于兩大分支中，被子植物中的單子葉植物水稻、玉米、小麥、毛竹與其他雙子葉植物處于不同分支，而雙子葉植物中擬南芥、油菜、白菜等十字花科在一個(gè)分支中，同屬藜科的大洋洲濱藜和甜菜在同一分支，同屬豆科的大豆和豌豆在同一分支，其他科、屬的植物也按此聚類，基本與現(xiàn)有的分類系統(tǒng)相符。但同為茄科的馬鈴薯栽培型、番茄、大葉煙草×花煙草為一個(gè)分支，而馬鈴薯野生型、矮牽牛、普通煙草則出現(xiàn)在較遠(yuǎn)的另一分支。

圖4 GAPC基因的進(jìn)化樹分析Fig．4 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide of GAPC

2．3 StGAPC和AtGAPC2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

將植物表達(dá)載體pBI121和克隆載體分別酶切，并回收相應(yīng)片段，純化連接，構(gòu)建了CaMV35S驅(qū)動(dòng)GAPC基因表達(dá)的載體。以重組子為模板PCR擴(kuò)增GAPC基因，可擴(kuò)增出約1000 bp左右的片段(圖5A)，用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，也可獲得1000 bp左右的片段(圖5B)。檢測(cè)結(jié)果說明GAPC基因片段已插入表達(dá)載體pBI121上，將獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pBI121-StGAPC和pBI121-AtGAPC2。

采用凍融法將兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105中，在含Kan的平板上獲得單菌落，各選2個(gè)單菌落提質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增Kan抗性基因nptⅡ和目的基因GAPC，如圖5所示，能擴(kuò)增出預(yù)期的650和1000 bp左右的片段，說明獲得了分別含pBI121-StGAPC和pBI121-AtGAPC2質(zhì)粒的兩種菌株。

圖5 表達(dá)載體PCR與酶切檢測(cè)Fig．5 Identification of expression vector by enzyme digestion

圖6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR驗(yàn)證Fig．6 Identification of EHA105 transformed into p lasm id by PCR

3 討論

胞質(zhì)3-磷酸甘油醛脫氫酶是由4個(gè)同型亞基組成的四聚體蛋白，Marri等［21］將擬南芥磷酸化GAPDH基因作了分類和表達(dá)研究，其中GapC為胞質(zhì)內(nèi)NAD依賴型的GAPDH，在糖酵解、糖質(zhì)新生代謝中行使功能，由2個(gè)基因GapC-1和GapC-2編碼，兩者cDNA相似性為89%，氨基酸序列相似性達(dá)97．9%，本實(shí)驗(yàn)克隆了其中的At-GAPC2基因。目前認(rèn)為造成克隆序列間差異的原因主要有品種差異、PCR擴(kuò)增時(shí)的堿基錯(cuò)配、測(cè)序錯(cuò)誤或者發(fā)生中性突變［22］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)序，篩選到了與Gen-Bank公布的序列完全一致的克隆。而同時(shí)測(cè)序的幾個(gè)克隆中，與公布序列在不同位置有1個(gè)或2個(gè)堿基的變異，這可能是PCR擴(kuò)增過程中的堿基錯(cuò)配造成。所克隆的StGAPC和AtGAPC2核苷酸序列的相似性為84%，氨基酸序列相似性達(dá)92%，氨基酸轉(zhuǎn)變會(huì)有疏水性變化，最終會(huì)使3D結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異，這些差異是否會(huì)造成StGAPC和AtGAPC2功能間的差異還需進(jìn)一步研究。

由于植物GAPC氨基酸序列間的同源性很高，遺傳密碼的兼并性可能會(huì)掩蓋進(jìn)化差別，降低進(jìn)化樹的可信度，因此本實(shí)驗(yàn)利用GAPC的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的分類系統(tǒng)基本相符，這與肖川等［6］對(duì)多個(gè)物種GAPDH基因的分子進(jìn)化研究結(jié)果相同，其研究表明葉綠體的GAPDH基因更接近原核生物，低等植物苔蘚較早分支，裸子植物和被子植物處于兩大分支，被子植物中單子葉植物和眾多雙子葉植物也處于不同分支，認(rèn)為GAPDH作為分子進(jìn)化研究材料有較高可信度。GAPC在同科、屬間的同源性較高，說明在進(jìn)化上較為保守，這與其參與糖酵解這一基本生理活動(dòng)有關(guān)。對(duì)其他不同基因的研究所構(gòu)建的進(jìn)化樹分析也表明各基因的屬內(nèi)同源性較高可歸于同一分支［22-25］。研究表明西伯利亞蓼的GAPDH可提高酵母的抗鹽堿脅迫能力，并且該基因與鹽生植物冰葉日中花的遺傳距離最近，推測(cè)逆境脅迫的作用使植物GAPDH基因的進(jìn)化方向和功能趨于相同［7］。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的進(jìn)化樹中，茄科植物出現(xiàn)了同屬但不在一個(gè)分支，不同屬反在同一分支的現(xiàn)象，如馬鈴薯栽培型(茄屬)、番茄栽培型(番茄屬)、大葉煙草×花煙草(煙草屬)為一個(gè)分支，而馬鈴薯野生型(茄屬)、矮牽牛(矮牽牛屬)、普通煙草(煙草屬)出現(xiàn)在另一分支。馬鈴薯栽培型在遺傳上是四倍體而野生型是二倍體，可能對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)及染色體倍性的變化影響著GAPC基因的進(jìn)化。進(jìn)化樹的構(gòu)建是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)問題，所構(gòu)建出來的進(jìn)化樹只是對(duì)真實(shí)進(jìn)化關(guān)系的模擬，所以單憑GAPC序列建立的進(jìn)化樹還不能充分反映出馬鈴薯栽培型和野生型間的進(jìn)化關(guān)系。

GAPC是糖酵解中的關(guān)鍵酶之一，催化3-磷酸甘油醛形成含高能磷酸鍵的1，3-二磷酸甘油酸和NADH，前者在下一步反應(yīng)中生成3-磷酸甘油酸和ATP，過去認(rèn)為GAPC在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定但近年來的研究表明GAPC具有功能多樣性。動(dòng)物中的研究表明GAPC除參與糖酵解外，還參與細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、氧化脅迫應(yīng)答、細(xì)胞自我吞噬、介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組蛋白基因調(diào)節(jié)等，并對(duì)GAPC在這些過程中的作用機(jī)理都有深入研究和解釋［26］。植物中發(fā)現(xiàn)GAPC能夠響應(yīng)多種逆境脅迫，但研究的深度滯后于動(dòng)物。關(guān)于GAPC響應(yīng)高溫、低溫、活性氧、低磷、鹽等多種逆境脅迫已被不同研究者所證實(shí)［8-12］，而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)也表明GAPC基因的過量表達(dá)能提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性［13-14］，抑制表達(dá)則影響代謝和生長(zhǎng)［27］。但目前關(guān)于GAPC在植物抗逆脅迫中如何起作用的研究還不夠深入，Zhang等［14］對(duì)水稻的研究表明OsGAPC3過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料中，與水稻抗逆相關(guān)的基因CatA、DREB2A、Lip9表達(dá)量高于對(duì)照，并且H2O2含量低，植株的耐鹽脅迫能力提高。這從一定程度上解釋了過量表達(dá)GAPC提高耐鹽脅迫的原因。Gou等［28］利用雙分子熒光互補(bǔ)充技術(shù)，發(fā)現(xiàn)H2O2能促進(jìn)擬南芥GAPCs和磷脂酶D的相互作用從而增強(qiáng)磷脂酶D的活性，證明GAPC參與ABA誘導(dǎo)的逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，這一研究揭示了GAPC的調(diào)節(jié)功能和作為逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的節(jié)點(diǎn)作用。本研究克隆了馬鈴薯和擬南芥GAPC，并構(gòu)建植物表達(dá)載體，這將為進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因和酵母雙雜等途徑研究?jī)烧咴隈R鈴薯抗逆中的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)，克隆了馬鈴薯和擬南芥的胞質(zhì)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的開放閱讀框序列(CDS)，對(duì)其核苷酸和氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)作對(duì)比分析，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體，為下一步基因功能的研究以及獲得耐逆境脅迫的材料奠定基礎(chǔ)。

［1］Cerff R，Chambers SE．Subunit structure of higher plant glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases(EC 1．2．1．12 and EC1．2．1．13)［J］．Journal of Biological Chemistry，1979，254:6094-6098．

［2］Plaxton W C．The organization and regulation of plantglycolysis［J］．Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology，1996，47:185-214．

［3］Brinkmann H，Martinez P，Quigley F，et al．Endosymbiotic origin and codon bias of the nuclear gene for chloroplastglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from maize［J］．Journal of Molecular Evolution，1987，26(4):320-328．

［4］Russell D A，Sachs M M．Differential expression and sequence analysis of themaize glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene family［J］．The Plant Cell，1989，1(8):793-803．

［5］Shih M C，Heinrich P，Goodman H M．Cloning and chromosomalmapping of nuclear genes encoding chloroplastand cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase from Arabidopsis thaliana［J］．Gene，1991，104(2):133-138．

［6］肖川，劉曉斐，詹樹萱，等．水稻甘油醛-3-磷酸脫氫酶cDNA結(jié)構(gòu)分析和分子進(jìn)化［J］．自然科學(xué)進(jìn)展，1998，8(4):411-419．

［7］李曉澤，劉關(guān)君，楊傳平．西伯利亞蓼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA克隆與序列分析［J］．植物生理學(xué)通訊，2007，43(1):41-48．

［8］Yang Y J，Hawk B K，Peng H P，etal．Stress responses andmetabolic regulation of clyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes in Arabidopsis［J］．Plant Physiology，1993，101:209-216．

［9］Penaloza E，Gutierrez A，Martinez J，et al．Differential gene expression in proteoid root clusters ofwhite lupin(Lupinus albus)［J］．Plant Physiology，2002，116:28-36．

［10］Wang X Y，Chen Y F，Zou JJ，etal．Involvementof a cytoplasmic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GapC-2 in low-phosphate-induced anthocyanin accumulation in Arabidopsis［J］．Chinese Science Bulletin，2007，52(13):1764-1770．

［11］Laxalt A M，Cassia R O，Sanllorenti PM，et al．Accumulation of cytosolic glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase RNA under biological stress conditions and elicitor treatments in potato［J］．PlantMolecular Biology，1996，30(5):961-972．

［12］Niu X，Wang H，Bressan R A，et al．Molecular cloning and expression of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in a desert halophyte，Atriplex nummularia L［J］．Plant Physiology，1994，104(3):1105-1106．

［13］Jeong M J，Park SC，Byun M O．Improvementof salt tolerance in transgenic potato plants by glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene transfer［J］．Molecules and Cells，2001，12:185-189．

［14］Zhang X H，Rao X L，Shi H T，et al．Overexpression of a cytosolic glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3 confers salt tolerance in rice［J］．Plant Cell Tissue and Organ Culture，2011，107:1-11．

［15］門福義，劉夢(mèng)云．馬鈴薯栽培生理［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993．

［16］王西瑤，朱濤，鄒雪，等．缺磷脅迫增強(qiáng)了馬鈴薯的耐旱能力［J］．作物學(xué)報(bào)，2009，35(5):875-883．

［17］楊乾，楊宏羽，劉玉匯，等．馬鈴薯適應(yīng)低磷脅迫的生理生化效應(yīng)［J］．分子植物育種，2011，9(2):224-229．

［18］吳平，印莉萍，張立平，等．植物營(yíng)養(yǎng)分子生理學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，2001．

［19］王西瑤．與擬南芥突變體lpt1、lks1性狀相關(guān)蛋白質(zhì)的分離、鑒定與功能分析［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．

［20］Hajirezaei M R，Biemelt S，Peisker M，etal．The influence of cytosolic phosphorylating glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase(GAPC)on potato tubermetabolism［J］．Journal of Experimental Botany，2006，(23):1-15．

［21］Marri L，Sparla F，Pupillo P，et al．Co-ordinated gene expression of photosynthetic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，phosphoribulokinase，and CP12 in Arabidopsis thaliana［J］．Journal of Experimental Botany，2005，56:73-80．

［22］牛繼平，張金文，王旺田，等．馬鈴薯SGAs合成代謝途徑末端SGT酶基因克隆及序列分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(3):106-116．

［23］李玉坤，王學(xué)敏，王贊，等．東方山羊豆脫水蛋白基因的克隆及初步分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(1):176-183．

［24］李立芹，黃玉碧，王西瑤．馬鈴薯WRKY6基因的克隆序列分析與原核表達(dá)研究［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20(2):177-183．

［25］董潔，王學(xué)敏，王贊，等．紫花苜蓿二氫黃酮醇還原酶基因(MsDFR)的克隆與分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(2):123-132．

［26］Sirover M A．On the functional diversity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase:Biochemicalmechanisms and regulatory control［J］．Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects，2011，1810:741-751．

［27］Rius SP，Casati P，Iglesias A A，et al．Characterization of Arabidopsis lines deficient in GAPC-1，a cytosolic NAD-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase［J］．Plant Physiology，2008，148:1655-1667．

［28］Gou L，Devaiah SP，Narasimhan R，et al．Cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogensaes interactwith phospholipase dδ to transduce hydrogen peroxide signals in the Arabidopsis response to stress［J］．The Plant Cell，2012，24:2200-2212．